腺相关病毒鼓阶转染小型猪耳蜗研究

摘要

目的：1.研究AAV1在以大型哺乳动物猪中的转染情况，通过与AAV1转染豚鼠耳蜗对比发现AAV1在小型猪中的转染与啮齿类动物的区别；2.构建过表达mitf腺相关病毒载体,为未来以小型猪作为动物模型的 Waardenburg综合征基因治疗及在mitf基因突变疾病的基因治疗中奠定基础。
　　方法：1.通过AAV1型病毒载体CAG启动子携带GFP报告基因，利用圆窗膜穿刺方式将病毒从鼓阶导入小型猪耳蜗细胞，观察1w，2w，3w，4w这四个不同时间点上绿色荧光蛋白的表达情况，发现 GFP在耳蜗中的表达的效率具有时间相关性。同时，我们观察在四个不同的时间点上，绿色荧光蛋白表达的细胞类型。同时，选取300-350g健康豚鼠，利用相同方法，观察腺相关病毒在豚鼠中的转染情况，通过与 AAV1转染豚鼠耳蜗对比发现 AAV1在小型猪中的转染与啮齿类动物的区别；2.通过PCR方法获取目的基因mitf，采用细胞内质粒DNA同源重组法进行重组腺相关病毒载体构建,利用柱纯化法纯化病毒载体，qPCR法测定重组腺相关病毒载体滴度，病毒载体感染 HEK293细胞进行病毒有效性及安全性鉴定，real-time PCR与western blot法进行mitf表达的鉴定。
　　结果：1.小型猪与豚鼠耳蜗转染的主要区域均为内毛细胞，外毛细胞区域几乎未发现表达GFP。除内毛细胞外，主要表达的支持细胞有Hensen’s细胞、内柱细胞、外柱细胞，同时表达在螺旋缘及螺旋韧带中。小型猪与豚鼠表达 GFP阳性细胞主要以底回为主，从底回到顶回表达逐渐减少，在顶回几乎没有出现成功转染。小型猪与豚鼠从2w开始底回内毛细胞表达，1w未出现耳蜗任何细胞表达GFP蛋白。小型猪表达高峰为3w，豚鼠表达高峰为2w。2.PCR获取目的基因mitf， DNA测序结果显示克隆mitf基因与正常mitf基因序列一致，DNA病毒滴度为1.0*10^12vg/ml。重组腺相关病毒载体转染HEK293细胞，提示病毒载体具有安全性及有效性。Real-time PCR及western blot检测重组腺相关病毒载体可以转录出mitf mRNA及MITF蛋白。
　　结论：1.本次实验首次利用小型猪作为耳聋基因治疗模型,将腺相关病毒载体鼓阶转染在小型猪耳蜗中有效表达,证实了AAV1携带基因在小型猪耳蜗中表达的细胞类型及随时间改变的情况，并且发现了基因表达在耳蜗细胞中随时间变化中小型猪与豚鼠的不同之处。2.本次研究首次成功构建过表达 mitf重组腺相关病毒载体,同时可以有效转录出正常mitf基因的mRNA并且可以表达出正常的MITF蛋白，这一载体的构建不仅为白化荣昌猪遗传性耳聋的基因治疗提供基础,也为未来进行 MITF突变导致的其他遗传性疾病的基因治疗提供新思路。

目录

声明

附录

前言

材料与方法

1.材料

1.1 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染小型猪耳蜗

1.2 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染豚鼠耳蜗

1.3 重组腺相关病毒的构建与鉴定

2.方法

2.1 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染小型猪耳蜗

2.2 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染豚鼠耳蜗

2.3 重组腺相关病毒的构建与鉴定

结果

1.AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染小型猪耳蜗

1.1不同时间点GFP在小型猪耳蜗内毛细胞上的表达情况

2.2 AAV1-GFP对小型猪耳蜗细胞毒性

2. AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染豚鼠耳蜗

2.1 不同时间点GFP在豚鼠耳蜗内毛细胞上的表达情况

2.2 AAV1-GFP对豚鼠耳蜗细胞毒性

2.3 AAV1-GFP在小型猪鼓阶中的转染特点及与豚鼠的研究对比

3.重组腺相关病毒的构建与鉴定

3.1 重组腺相关病毒AAV-MITF的构建及鉴定

2.2 重组腺相关病毒AAV-MITF的滴度测定

2.3 重组腺相关病毒AAV-MITF感染HEK293细胞

2.4 MITF基因Real-time PCR鉴定及Western blot鉴定

讨论

1.AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染小型猪耳蜗

2.AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染豚鼠耳蜗

3.重组腺相关病毒的构建与鉴定

结论

参考文献

综述:腺相关病毒在遗传性非综合征感音神经性耳聋基因治疗上的应用

致谢