异构酶Pin1对瑞戈非尼耐药前后肝癌细胞侵袭转移的影响及机制研究

摘要

目的：肝癌是全球发病率位居第六的癌症，但目前已成为癌症致死的第二大因素。今一线靶向药Sorafenib，已出现耐药及肝癌转移复发，然而新被批准的二线治疗药物瑞戈非尼（Regorafenib）是否会发生耐药及耐药后的相关机制均不清楚。此前的研究表明，脯氨酰顺反异构酶Pin1在肝癌的发生发展中发挥着重要作用。因此，本文重点考察在肝癌细胞瑞戈非尼耐药前后，Pin1对侵袭转移的影响，并从EMT的角度探讨其相关机制，以发现潜在缓解肝癌瑞戈非尼耐药的策略。
　　方法：（1）Western Blot及免疫荧光实验检测肝癌临床标本中Pin1及EMT相关蛋白表达的关系。（2）五质粒系统包装Pin1敲减或过表达的慢病毒，感染MHCC-97H、Huh7、THLE3细胞,筛选建立稳定敲减或过表达Pin1的肝癌细胞株。（3）以SMMC-7721肝癌细胞为研究对象，采用Regorafenib药物低浓度（0.5μM）开始，梯度间歇诱导的方法，筛选出瑞戈非尼耐药株SMMC-7721-R-R；计算出相应的耐药指数（resistance index，RI=耐药细胞的IC50/亲代细胞的IC50）。（4）相差显微镜观察并拍照收集肝癌细胞耐药前后及Pin1敲减前后细胞形态的改变。（5）观察Pin1敲减或过表达对MHCC-97H、Huh7、THLE3、SMMC-7721-R-R细胞株生物学行为的影响：生长曲线及平板克隆实验检测Pin1敲减或过表达对细胞增殖能力的影响；Transwell小室实验及划痕实验检测Pin1敲减或过表达对细胞迁移侵袭能力的影响；（6）Western Blot及免疫荧光实验检测Pin1敲减对EMT相关蛋白、干性相关蛋白及Gli1通路蛋白表达影响。（7）构建裸鼠尾静脉注射肺转移模型，HE染色及免疫荧光检测Pin1敲减对肝癌细胞体内转移的影响。（8）干细胞培养条件，检测SMMC-7721细胞瑞戈非尼耐药前后，Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA对肝癌细胞成球能力的影响。
　　结果：（1）肝癌临床标本中，Pin1表达与EMT相关蛋白表达水平具有一定关系。（2）成功构建了稳定敲减Pin1的肝癌细胞株，Huh7细胞中Pin1下调88%,MHCC-97H细胞中Pin1下调76%。（3）成功构建SMMC-7721瑞戈非尼耐药细胞株SMMC-7721-R-R，RI=1.53，为低度耐药。（4）Pin1敲减后细胞发生了明显的MET表型变化，表现为细胞极性的回复，细胞由不规则的形态变为排列整齐，形态规则的铺路石状细胞。（5）Pin1敲减或ATRA作用后，细胞增殖及克隆形成能力显著受到抑制（P＜0.001）；Transwell小室及划痕实验表明，Pin1敲减使细胞迁移侵袭能力明显减弱（P＜0.001）。（6）Western Blot及免疫荧光结果显示Pin1敲减后，Pin1表达显著下调，上皮标记物E-cadherin表达显著上调，间质标志物Vimentin表达显著下调，转录因子Snail显著下调，Gli1显著下调。瑞戈非尼耐药株中干性相关基因Bmi1显著下调。（7）Pin1敲减有效减弱了细胞在裸鼠体内的转移能力（P＜0.001）。（8）肝癌细胞株瑞戈非尼耐药后，细胞成球能力明显增强，干性增加；Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA作用后，肝癌细胞瑞戈非尼耐药株干性相关蛋白的表达减少，成球能力明显受到抑制。
　　结论：（1）肝癌细胞瑞戈非尼耐药后细胞迁移侵袭及体内转移能力显著增加，Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA可有效抑制肝癌细胞的增殖及瑞戈非尼耐药前后肝癌细胞的迁移侵袭及体内转移能力。（2）Pin1可能通过Gli1控制EMT相关蛋白的表达进而调控肝癌细胞瑞戈非尼耐药前后的迁移侵袭及体内转移能力。（3）Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA能明显抑制肝癌细胞瑞戈非尼耐药后的干细胞成球能力。Pin1在肝癌细胞瑞戈非尼耐药前后的调节作用为临床指导瑞戈非尼用药及抑制肝癌瑞戈非尼耐药后的转移复发提供了有效的临床指导，对于肝癌的治疗具有指导意义。

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