水稻种子发育特异性表达锌指基因的筛选及功能分析

摘要

锌指蛋白基因是植物基因组中最大最复杂的基因家族之一，许多锌指蛋白被推测为转录因子。研究表明它们在花发育、光形态建成、种子发育等植物特有的生物学过程中发挥着重要的调节作用。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，探讨锌指基因在水稻发育，特别是种子发育过程中的调控作用，将不仅有助于对水稻种子发育过程分子机制的了解，而且对改良水稻的产量和品质具有重要的实践价值。　　本研究利用关键词及网络资源，在各种数据库中搜索到了1300多条水稻锌指蛋白基因序列，通过比较分析，选择其中354个未知功能的水稻锌指基因序列设计引物。利用RT-PCR技术分析了这些锌指基因在水稻不同器官及种子不同发育阶段的表达特征，筛选出一批种子特异性、茎和／或叶、根特异性表达的锌指基因及可能为组成型表达的锌指基因，其中有10个锌指基因在水稻种子发育过程特异性表达。这些结果为我们进一步洞察锌指基因在种子发育过程中的作用创造了条件。　　在对10个水稻种子发育特异性表达锌指基因进行序列分析的基础上，选择了其中的3个(ZF54、ZF77、ZF309)开展进一步研究。分别构建了锌指基因ZF54、ZF77、ZF309上游启动子区与GUS的融合表达载体pC54P-GUS、pC77P-GUS和0C309P-GUS及ZF54和ZF309的cDNA正义和反义表达载体pCU54S、pClJ54A、pCA309S和pCA309A；以期进一步了解它们的表达特征及其生物学功能。　　通过农杆菌介异法，分别获得了上述各载体的再生植株并种植于大田中。PCR检测表明pC54P-GUS，pC 77P-GUS,pC309P-GS,pCU54S和pCu54A等5个载体的重组片段均已整合进水稻基因组中。TO代GUS活性分析显示：pC54P-GUS只在水稻种子中检测到GUS表达，在根、茎、叶、颖花中均没有检测到GUS活性，显示了种子发育特异性表达特征；pC77P-GUS的大多数转基因植株在所有组织及发育阶段均检测到GUS活性，表现了与RT-PCR．不同的表达特征，其原因可能是克隆的ZF77上游启动子片段的长度不足或克隆序列本身的碱基错误所致，真实原因有待进一步构建载体分析。转pC309P-GUS植株尚未抽穗，但在分蘖期的根、茎、叶中尚未检测到GUS活性。转基因阳性植株太少，对pCU54S、pCU54A转基因TO植株的田间表型调查尚待这两个载体新的转基因植株再生。 锌指基因家族是生物体内一个比较大的基因家族，推测总的锌指基因数目可占各生物基因总数的2～4％。随着水稻基因组序列的不断阐释，克隆和推定的水稻锌指基因也在不断增加。研究显示，植物锌指蛋白在花发育、光形态建成、种子发育以及环境胁迫反应等过程中均具有至关重要的调节作用。水稻生产在我国国民经济中占有举足轻重的地位，水稻种子发育是水稻生长和发育中变化最剧烈的生物学过程之一，其间涉及大量的基因的表达和调控。因此，探讨锌指基因在水稻种子发育过程中是否存在重要的调控作用，将不仅有助于对植物种子发育过程分子机制的了解，而且对改良水稻的产量和品质具有重要的实践价值。 本研究基于已有和不断增加的水稻基因组信息资源，通过关键词和各种数据库收集到1300多条水稻锌指蛋白基因序列，通过比较分析，选择其中354个未知功能的水稻锌指基因序列设计引物。利用RT-PCR技术分析了这些锌指基因在水稻不同器官及种子不同发育阶段的表达特征，筛选出一批种子特异性、茎、叶和／或根特异性表达的锌指基因。在对10个种子特异性表达的锌指基因进行基本的生物信息学分析的基础上，选择其中3个锌指基因构建相关表达载体开展其功能分析。 其主要实验内容及结果如下： l、354个水稻锌指基因的表达特征分析 利用Trizol法提取水稻根、茎、叶、花及不同发育时期种子的总RNA，RT-PCR分析了354个锌指基因在不同组织(器官)及种子不同发育阶段的表达特征。结果发现：354个锌指基因中有138个锌指基因引物能够在水稻根、茎、叶、花、种子中的一个或几个或所有器官中扩增出与预计大小相同的RT-PCR片段，初步筛选出一些器官或种子不同发育阶段特异性表达的锌指基因。如10个锌指基因在水稻种子发育中、3个在叶中、2个在根中、1个在茎中特异性表达，有8个锌指基因倾向在花和种子中、5个在叶和种子中、2个在茎和种子中表达等，另有大量的锌指基因倾向在三个或所有检测器官中表达。水稻锌指基因的这些表达特征暗示了锌指基因可能参与了水稻生长发育的许多重要生物学过程的调控。 2、水稻种子特异性表达锌指基因的克隆及表达载体构建 对10个水稻种子特异表达锌指基因进行基本的生物信息学分析发现：它们均推测为转录因子。其中有6个为CCCH型锌指蛋白，2个C2H2型锌指蛋白，1个DHHC型和1个未分类型锌指蛋白，表明CCCH型锌指基因在种子发育过程可能有很重要的调控作用。 为了深入地了解水稻种子发育特异表达锌指基因的生物学功能，我们选择了3个CCCH型锌指基因(ZF54、ZF77、ZF309)进行进一步遗传分析。分别构建了锌指基因ZF54、ZF77、ZF309上游启动子区与GUS的融合表达载体(pC54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS)及ZF54和ZF309的cDNA正义和反义表达载体(pCU54S,pCU54A,pCA309S和pCA309A)：以期进一步了解它们的表达特征及其生物学功能。 3、转基因植株的获得及其分子检测 将构建好的7个载体，用农杆菌介导法转化日本晴水稻成熟胚诱导的愈伤组织。目前，除pCA309S和pCA309A的转化材料正在分化中，其余5个表达载体均已获得转基因再生植株。根据潮霉素选择标记基因hpt引物，用PCR分别对5个表达载体的再生植株进行分子检测。结果发现pC54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS分别获得阳性克隆数为：4个、12个和22个，可用于GUS表达活性分析；而pCU54S和pCU54A的阳性克隆数分别仅1个和2个，对这两个质粒需进行新的遗传转化，目前已获得新的抗性愈伤组织正在分化中。 4、转基因植株GUS活性检测 利用组织化学染色法我们分别对pC54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS的阳性转基因植株进行GUS活性分析，取花、根、茎、叶、种子(前、中、后期)进行GUS(β-葡萄糖苷酸酶)的组织化学染色。结果显示：pC54P-GUS的4株阳性转基因TO植株只在种子检测GUS表达，在根、茎、叶、颖花中均没有检测到GUS活性。该结果与我们用RT-PCR分析的ZF54基因的表达特征一致，暗示了ZF54蛋白可能为水稻种子发育特异性调节因子。 pC77P-GUS的12个阳性克隆中，在大多数克隆(8个)的根、茎、叶、花及种子中均能检测到GUS活性，与RT-PCR检测结果明显不一致。其原因可能是克隆的ZF77上游启动子片段的长度不足或克隆序列本身的碱基错误所致，真实原因尚待进一步构建载体分析。 pC309P-GUS转基因植株尚未抽穗，但分蘖期的根、茎、叶中尚未检测到GUS活性。其它载体的转基因植株的检测工作以及对pCU54S、pCU54A、pCA309S和pCA309A转基因植株的表型分析尚在进行中。

目录

摘要

中文文摘

第1章绪论

第2章水稻种子发育特异性表达锌指基因的筛选

第3章水稻种子发育特异性表达锌指基因的克隆及表达载体构建

第4章载体转化及转基因再生植株的检测

结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

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