黄麻单染色体的分离和扩增及cDNA探针高通量筛选初探

摘要

微分离微克隆技术对植物的遗传研究具有重要的应用价值.但是,由于大多数植物的染色体都很小且形态上难以识别,因而该技术在植物中的应用很少.该研究以具有典型小染色体的植物黄麻为模式,对单染色体的分离和体外扩增以及利用单染色体未克隆DNA文库和cDNA膜阵列高通量地筛选特定染色体的特异cDNA探针进行了探讨.主要结果如下:1)用玻璃针显微分离法成功分离到了长果种黄麻(Corchorus olitoriusL)闽引一号和圆果种黄麻(Corchorus capsularis L.)高雄青皮单染色体各80条.2)将分离到的闽引一号和高雄青皮单染色体分别进行LA-PCR和DOP-PCR两种方法的两轮扩增,分别得到250-2000bp和100-600bp之间的DNA片段.用LA-PCR共扩增闽引一号和高雄青皮单染色体各45条;用DOP-PCR共扩增闽引一号和高雄青皮单染色体各5条,从而建立了闽引一号和高雄青皮单染色体未克隆文库各50个.Southern杂交表明,获得的扩增片段确实来自黄麻基因组.3)分别构建了闽引一号和高雄青皮的cDNA文库,两个文库的滴度均达到了1.8-1.9×106个pfu/ml.4)用同位素标记单染色体未克隆DNA文库,运用cDNA膜阵列杂交进行高通量探针筛选的探索.结果预示了应用cDNA膜阵列高效率筛选特定染色体特异探针的可行性.这一探索性研究将对黄麻单染色体的分类和建立高密度分子标记连锁图谱及染色体进化和比较基因组研究奠定基础.

目录

前言

文献综述

1.黄麻的分类与遗传研究

1.1黄麻分类研究

1.2黄麻的遗传研究

2.植物染色体微分离、微克隆技术研究进展

2.1染色体微分离、微克隆技术的原理

2.2染色体微分离、微克隆技术程序

2.3染色体微分离、微克隆技术在植物中的应用

2.4植物染色体微分离、微克隆技术存在的问题

第一章 黄麻单染色体的显微分离及体外扩增

1.材料和方法

1.1供试材料

1.2染色体标本的制备

1.3染色体的显微分离

1.4单染色体的体外扩增

1.5单染色体扩增产物的Southern杂交检验

2.结果与分析

2.1黄麻染色体标本的制备

2.2黄麻单染色体的显微分离

2.3单染色体的体外扩增

2.4 Southern杂交分析

3.讨论

3.1单染色体微分离的关键技术

3.2单染色体扩增的污染问题

3.3扩增片段大小的影响因素

第二章黄麻cDNA文库构建与探针筛选初探

1.材料与方法

1.1供试材料

1.2黄麻总RNA提取和mRNA的获得

1.3第一链cDNA合成

1.4 cDNA的LD PCR扩增

1.5蛋白酶消化与Sfi Ⅰ酶切

1.6 cDNA分级

1.7 cDNA与λTriplEx2载体连接

1.8包装

1.9细菌平板培养

1.10滴度测定

1.1插入片段大小鉴定

1.12λTriplEx2阳性克隆向pTriplEx2质粒克隆的转化与片段鉴定

1.13菌落点于高密度膜上，用于膜阵列杂交分析

1.14 eDNA膜阵列杂交筛选探针

2.结果与分析

2.1黄麻总RNA提取

2.2 eDNA合成

2.3 eDNA的分级

2.4 eDNA文库滴度测定

2.5插入片段大小鉴定

2.6菌落点于高密度膜上后的生长情况

2.7 eDNA膜阵列杂交筛选探针

3.讨论

3.1 eDNA文库构建的关键环节

3.2 eDNA膜阵列杂交筛选探针的探索

4.下一步工作计划

参考文献

附录A

附录B

致谢