水稻齿叶矮缩病毒基因组S8和S10片段的原核表达及抗血清制备

摘要

水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员，。RRSV基因组包括10条双链RNA片段(S1-S10)，本文报道了福建农林大学植物病毒研究所分离纯化并经室内保存20多年的RRSV福建沙县分离株(RRSV-F)的基因组S8和S10片段的编码区克隆、原核表达、Pns10融合蛋白抗血清的制备和P8蛋白的系统进化分析结果。　　通过有机试剂抽提，CF-11纤维素柱层析，从感病水稻叶片中获取该病毒的全基因组，根据RRSV泰国分离株(RRSV-T)S10开放阅读框(ORF)核苷酸序列(nt142-1035)和S8开放阅读框核苷酸序列(nt23-1810)分别设计引物，通过RT-PCR方法扩增出特异性目的条带。PCR扩增产物经回收、连接、转化DH5a大肠杆菌克隆至pMD18-T载体上，经蓝白斑和氨苄青霉素抗性筛选和双酶切和PCR法鉴定，分别获得了重组质粒pMD18-TS10和pMD18-TS8，并进行了序列测定和分析。　　本文利用DirectionalTOPO克隆技术将平整末端单向克隆的S10和S8基因分别转入pET100/D-TOPO载体，构建了原核表达载体，并在BL21star(DE3)E.coli中得到了高效表达，分别获得了约35kD的Pns10融合蛋白和70kD的P8融合蛋白。将获得的Pns10融合蛋白免疫大耳白兔制备了抗血清，间接ELISA法测定抗血清效价为1：7680，效价高，Westernblot鉴定表明抗血清特异性强。表达产物及多克隆抗体的获得为下阶段深入研究提供了实验材料。

目录

独创性声明及关于论文使用授权的说明

摘要

1前言

1.1水稻齿叶矮缩病毒研究概况

1.1.1 RRSV的生物学特性

1.1.2病害流行学

1.1.3病毒粒体特征和细胞病理学

1.1.4 RRSV的基因组结构及组成和功能

1.2本项目研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1病毒分离物

2.1.2载体和菌株

2.1.3试剂及酶类

2.1.4试验动物

2.1.5供试仪器及其它

2.2实验方法

2.2.1 RRSV-dsRNA和病叶总RNA的提取

2.2.2 RNA的分析和定量

2.2.3 RRSV基因组S8和S10片段编码区的扩增

2.2.4克隆操作

2.2.5 RRSV基因组S10和S8片段的原核表达

2.2.6 RRSV P10融合蛋白抗血清的制备

2.2.7生物信息学分析

3结果与分析

3.1 RRSV-dsRNA的提取及纯化

3.2 RRSV基因组S10片段的克隆及序列分析

3.2.1 S10片段基因克隆

3.2.2序列测定及分析

3.3基因组S8片段的克隆

3.3.1 S10片段基因克隆

3.3.2序列测定及分析

3.4外层衣壳蛋白系统进化分析

3.5 RRSV基因S10和S8片段的原核表达

3.5.1 RRSV S10基因的原核表达

3.5.2 RRSV S8基因的原核表达

3.6 RRSV基因组S10片段融合蛋白抗血清的制备

3.6.1融合蛋白抗血清效价的测定

3.6.2 Western-Blot分析

4讨论

4.1水稻齿叶矮缩病毒的起源

4.2 RRSV S10和S8基因克隆和原核表达

4.3 RRSV S10融合蛋白的抗血清制备

小结

参考文献

附录1构建系统进化树所用的病毒及其序列号和属名

附录2主要试剂的配制

致谢