水稻矮缩病毒Pns10和Pns11基因的原核表达及抗血清制备

摘要

水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus，RDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员，能引起水稻矮缩病。最早于1883年，在日本首先被发现，现今主要流行于日本、朝鲜、东南亚以及我国东南部等水稻产区，对水稻生产造成一定影响。RDV基因组包括12条双链RNA片段(S1-S12)，本文通过对云南RDV分离物基因组S10和S11片段编码区克隆，原核表达并制备了Pns10和Pns11融合蛋白的抗血清，为进一步研究基因的功能奠定了基础。 利用Trizol法从感病水稻叶片中获取该病毒的全基因组，根据RDV福建分离株(RDV-F)S10开放阅读框(ORF)核苷酸序列(nt14-1075)和S11开放阅读框核苷酸序列(nt30-575)分别设计含有合适酶切位点的引物，通过RT-PCR方法扩增出特异性目的条带。PCR扩增产物经回收、连接、转化DH5α大肠杆菌克隆至pMD18-T载体上，经蓝白斑和氨苄青霉素抗性筛选、PCR和双酶切法鉴定，分别获得了重组质粒pT-S10和pT-S11，并进行序列测定。应用生物信息学软件对编码蛋白的理化性质、跨膜区、功能域及蛋白的二级结构进行预测分析。 重组质粒经双酶切后分别将目的基因转入pGEX-4T-1载体，获得原核表达载体pGEX-S10和pGEX-S11。将原核表达载体转入BL21star(DE3)E.coli中得到了高效表达，分别获得了约59kD的Pns10融合蛋白和46kD的Pns11融合蛋白。将获得的两个融合蛋白分别免疫大耳白兔制备了特异性抗血清，间接ELISA法测定抗血清效价为1∶2048和1∶3072，Westernblot鉴定表明抗血清特异性强。表达产物及多克隆抗体的获得为下阶段深入研究提供了实验材料。

目录

独创性声明及论文使用授权的说明

摘要

1前言

2材料和方法

3结果与分析

4讨论

小结

参考文献

附录1主要试剂的配制

附录2 Pns10蛋白的二级结构预测

致谢