西尼罗病毒巢式RT-PCR和荧光定量RT-PCR两种检测方法的建立

摘要

本文建立了检测西尼罗河病毒的巢式反转录PCR、荧光定量RT-PCR技术。　　本研究采用西尼罗河病毒的1999年北美分离株，针对该病毒的保守蛋白E基因设计了巢式反转录PCR的引物，引物经Blast和常规PCR鉴定具有很好的特异性。试验采用的RNA模板来自质粒DNA的体外转录产物。反应的第一步反转录PCR和第二步巢式PCR分别扩增出长度为445bp和248bp的两条片段。该法的特异性和敏感性均很好，可检测到拷贝数为6×100拷贝的病毒RNA。　　荧光PCR反应产生实验室交叉污染的机率比巢式反转录PCR要低得多。本研究中，试验者建立了基于TaqMan探针的反转录荧光PCR技术，这种技术的最低敏感度达到3×101RNA拷贝。本试验同样采用西尼罗河病毒的1999年纽约分离株进行研究，针对该病毒的E基因区设计了一对寡核苷酸引物和一条由FAM和TAMRA标记的特异性探针，反应的模板RNA来自质粒DNA的体外转录产物。试验过程中还对荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的敏感性进行了比较，结果表明荧光RT-PCR技术的特异性和敏感性均高于常规RT-PCR法。

目录

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摘要

引言西尼罗河病毒研究进展

1西尼罗河病毒简介

1.1西尼罗河病毒病原学

1.2临床表现

2流行病学

2.1传染源

2.2传播媒介

2.3传播方式

2.4易感动物

2.5流行分布特点

3世界流行趋势

3.1流行简史

3.2重大历史事件

4诊断技术研究进展

4.1 ELISA技术

4.2反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术

4.3反转录巢式聚合酶链式反应(RT-nPCR)技术

4.4实时荧光定量反转录PCR(Real time RT-PCR)技术

4.5基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification Assay，NASBA，也称自主序列复制)技术

5西尼罗河病毒传入我国的风险分析

6我国防范西尼罗病毒入侵的措施

7 小结

参考文献

第一章西尼罗河病毒反转录巢式PCR(RT-NPCR)检测方法的建立

1材料和方法

1.1重组质粒和日本乙型脑炎病毒冻干苗

1.2引物的设计与合成

1.3主要试剂

1.4主要仪器设备

1.5原始质粒的转化和扩增及日本乙型脑炎病毒病毒RNA的提取

1.6常规PCR法扩增目的片段

1.7琼脂糖凝胶电泳

1.8用于体外转录的DNA模板的构建

1.9体外转录

1.10RT-n PCR检测技术的建立

2结果

2.1常规PCR法扩增目的片段切胶纯化结果

2.2菌液PCR筛选阳性菌落结果

2.3体外转录模板的线性化结果

2.4体外转录结果

2.5 RT-n PCR扩增目的片段及特异性反应结果

2.6 RT-n PCR的敏感性试验结果

3讨论

参考文献：

第二章西尼罗河病毒基于TAQMAN探针REAL TIME RT-PCR检测方法的建立

1材料和方法

1.1重组质粒及日本乙型脑炎病毒冻干苗

1.2引物和探针的设计与合成

1.3主要试剂

1.4主要仪器设备

1.5 Real time RT-PCR检测方法的建立

2结果

2.1常规PCR法扩增目的片段结果及切胶纯化PCR产物结果

2.2菌液PCR筛选阳性菌落结果

2.3阳性菌液测序结果

2.4体外转录模板的线性化结果

2.5体外转录结果及纯化后结果

2.6常规RT-PCR敏感性分析结果

2.7Real time RT-PCR扩增目的片段及特异性反应结果

2.8Real-time RT-PCR敏感度分析及其标准曲线的建立

2.9Real-time RT-PCR的可重复性

3讨论

参考文献

结论

致谢

附图