嗜水气单胞菌主要粘附素基因克隆表达及其产物特性分析

摘要

从鳗源嗜水气单胞菌ZN1克隆到其主要粘附素基因(major adhesin gene，Mah)。该基因开放阅读框为1074bp，编码357个氨基酸，推导的蛋白分子量为39.606kDa，前22个氨基酸残基构成一明显疏水信号肽。DNA序列分析比较表明ZNl主要粘附素基因与其它嗜水气单胞菌主要粘附素基因同源率约为70％，在系统进化树中，属于嗜水气单胞菌主要粘附素基因的一个新亚群。将Mah重组到pET-32a表达载体中并转化E.coliDE3(BL21)，获得高效表达。表达产物验证与功能分析结果表明：(1)ELJSA结果显示鼠抗ZN1主要外膜蛋白血清能识别表达产物Mah-TrxA(硫氧还蛋白与主要粘附素形成的融合蛋白)及野生型菌株ZN1表达的主要外膜蛋白(含主要粘附素)，抗体滴度分别达到1：3200和1：12800；鼠抗Mah-TrxA融合蛋白血清可识别Mah-TrxA及野生型菌株ZN1表达的主要外膜蛋白，抗体滴度分别到达1：12800和1：1600；(2)免疫印迹显示鼠抗ZNl主要外膜蛋白血清能识别Mah-TrxA和野生菌主要外膜蛋白的相关条带；鼠抗Mah-TrxA血清可识别Mah-TrxA和其它5种不同血清型野生型嗜水气单胞菌主要外膜蛋白的相关条带；(3)Mah-TrxA的功能分析表明ZN1主要外膜蛋白、Mah-TrxA和兔抗Mah-TrxA血清能显著抑制或阻断菌ZN1粘附于EPC细胞的能力，但都不能完全抑制或阻断ZN1对EPC细胞的粘附；(4)以Mah-TrxA经腹腔免疫欧洲鳗鲡，接种30天后，免疫欧洲鳗鲡可抵抗1×10<'7>cfu野生型ZN1的攻击，免疫保护率达87.5％。以上结果表明：通过基因工程技术以融合蛋白形式表达的嗜水气单胞菌主要粘附素与野生菌株ZN1表达的主要粘附素生物学活性相类似，且具有良好的免疫原性，可诱导动物产生特异性抗体和免疫保护力；免疫印迹试验结果提示不同血清型嗜水气单胞菌主要粘附素的抗原性高度相关，主要粘附素可能是不同菌株之间的共同抗原成份。 本研究成功地克隆、表达了嗜水气单胞菌Mah基因，较为系统地分析了表达产物的生物学特性和功能，进一步揭示了嗜水气单胞菌产生粘附作用的本质因素，以及主要粘附素在侵入宿主和诱导宿主产生免疫保护过程中的功能和作用，为嗜水气单胞菌病的有效防治提供有价值的研究资料。

目录

声明

摘要

前 言

第一部分文献综述

第二部分鳗源嗜水气单胞菌主要粘附素基因克隆及其原核表达载体构建

1.材料

2.方法

2.1引物设计

2.2嗜水气单胞菌ZN1基因组的提取

2.3 PCR扩增嗜水气单胞菌ZN1主要粘附素基因

2.4 PCR产物纯化

2.5大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli DE3(BL21)感受态细胞制备

2.6 Mah基因的克隆

2.7 PCR鉴定阳性克隆

2.8酶切鉴定

2.9 Mah基因表达载体的构建

3.结果与分析

3.1 Mah基因的克隆、鉴定

3.2 Mah基因序列分析

3.3表达载体的构建

4.讨论

4.1引物酶切位点的设计

4.2目的基因的选择

4.3表达载体的选择

第三部分鳗源嗜水气单胞菌主要粘附素基因的表达及其产物的纯化复性

1.材料

2.方法

2.1 Mah基因表达产物Mah-TrxA融合蛋白的可溶性及分布情况分析

2.2 Mah基因表达条件优化

2.3 Mah-TrxA融合蛋白的制备及复性

3.结果与分析

3.1 Mah基因表达产物Mah-TrxA融合蛋白的可溶性及分布情况分析

3.2 Mah基因表达条件优化

3.3 Mah-TrxA融合蛋白的制备及复性

4讨论

4.1包涵体纯化溶解

4.2蛋白复性

第四部分Mah-TrxA融合蛋白的生物学特性分析

1.材料

2.方法

2.1制备嗜水气单胞菌主要外膜蛋白

2.2血清的制备

2.3 Mah-TrxA融合蛋白生物学特性分析

3.结果与分析

3.1 Mah-TrxA融合蛋白的抗原性分析

3.2 Mah-TrxA融合蛋白免疫原性分析

3.3共同保护性抗原成分分析

3.4粘附素功能分析

3.5免疫保护试验

4.讨论

4.1 Mah-TrxA融合蛋白抗原性分析

4.2 Mah-TrxA融合蛋白免疫原性分析

4.3共同抗原成份分析

4.4粘附素功能分析

4.5免疫保护试验

结论

参考文献

附录

致谢