嗜水气单胞菌主要粘附素基因序列及其重组基因表达产物功能分析

摘要

为了深入探讨不同嗜水气单胞菌(Ah)之间主要粘附素基因在序列方面的差异以及主要粘附素的功能,了解主要粘附素在菌体侵入宿主和介导宿主产生免疫过程可能扮演的角色,对6株Ah菌主要粘附素基因进行克隆、测序,同时对Ah菌ZN1株主要粘附素重组基因的表达条件进行了优化,并对表达产物的部分生物学功能进行了分析,获得如下结果。
　　 核苷酸和氨基酸序列分析结果表明:6株Ah菌主要粘附素基因核苷酸和氨基酸同源率范围分别为35.6％～99.6％和34.2％～99.5％;相同来源且相同血清型的菌株BL①和BL④之间,主要粘附素基因核苷酸同源性最高为99.6％,对应氨基酸的同源性为84.6％;不同来源且不同血清型的菌株BL①和TPS-30之间主要粘附素基因核苷酸同源性为98.1％,对应氨基酸的同源性仅42.3％;此外,菌株ZN1(血清型为0:10501、分离自欧洲鳗鲡)的主要粘附素氨基酸序列与其他菌株差异较大同源率仅为34.2％～63.6％。结果提示嗜水气单胞菌菌株间主要粘附素基因核苷酸和氨基酸同源性与菌株来源和血清型没有严谨的相关性,而呈现出一定的多样性。
　　 主要粘附素基因重组表达条件优化结果表明:嗜水气单胞菌ZN1株主要粘附素基因(Mah)重组菌.Ecoli BL21(命名为ZAPB)在诱导前增菌4hrs、5hrs的表达效果优于增菌2hrs、3hrs;在添加不同诱导物IPTG浓度(0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L)条件下,表达效果相近;诱导表达2hrs、3hrs的效果优于4hrs和5hrs;在27℃条件下,诱导表达的效果优于30℃、33℃和37℃;此外,增加通氧量、调节培养基pH值(分别为6.0和8.0)和低温延时表达(16℃诱导8h)都不能改善表达效果,且表达产物也主要以包涵体的形式存在。结果表明ZAPB最佳表达条件为:摇床转速200r/min,诱导前预增菌4hrs,菌液浓度在OD600=0.6～0.8之间,诱导物IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导温度27℃,诱导表达3hrs。
　　 主要粘附素基因重组表达产物免疫学特性与功能分析的结果表明:(1)交叉EIASA结果显示,兔抗基因供体菌ZN1株的天然外膜蛋白(ZN1-OMP)血清对表达产物Mah-TrxA(硫氧还蛋白与主要粘附素形成的融合蛋白)及ZN1-OMP的反应滴度分别为1∶3200和1∶12800;兔抗Mah-TrxA血清对Mah-TrxA及ZN1-OMP的反应滴度分别为1∶12800和1∶1600,说明表达产物和天然外膜蛋白具有类似的免疫学特性。(2)粘附试验显示,鱼源Ah菌ZN1株和BL①株(血清型O:Ah10501)、TPS-30株和Ah9805株(血清型0:9)及CQ-3株(血清型O:CQ-1)对鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)的相对粘附率高达97％以上;非鱼源Ah菌ATCC7966株(血清型O:1)对EPC的相对粘附率为78.5％。(3)粘附抑制和阻断试验显示,EPC经Mah-TrxA预孵育后,与不同Ah菌株进行粘附试验,EPC的平均粘附菌数仅为0.3～3.9(＜10);供试的不同Ah菌株经兔抗Mah-TrxA血清预孵育后,与EPC进行粘附试验,EPC的平均粘附菌数也仅为0.3～3.7(＜10)。结果提示Mah-TrxA对不同Ah菌株有交叉抑制的作用,抗原竞争性抑制试验和抗体阻断试验均能显著减少不同Ah菌株对EPC的粘附作用,从正反两个方面都提示克隆、表达的Mah-TrxA确为ZN1菌株的主要粘附素:同时还证实借助基因工程技术以融合蛋白形式表达的Mah-TrxA与野生菌株ZN1表达的主要粘附素具有类似的生物学活性。
　　 综上所述,本研究课题分析比较了6株不同Ah菌主要粘附素基因的核苷酸和氨基酸的同源性,阐明Ah主要粘附素基因同源性与菌株来源和血清型没有严谨的相关性;验证了Mah-TrxA对鱼类细胞的粘附功能,证实了Mah是ZN1菌株的主要粘附素基因;交叉抑制试验证明Mah-TrxA融合蛋白能够抑制不同来源和血清型Ah菌株对EPC的粘附,结果提示不同Ah菌株的粘附位点具有一定的保守性。这一发现也许能为鱼类嗜水气单胞菌疾病的防控提供一种新的思路。