南方根结线虫RNAi胚致死效应基因的筛选与功能鉴定

摘要

根结线虫是一种极难防治的世界性分布的土传病害，每年可给农业造成约1000亿美元的损失，己然成为制约我国蔬菜种植业可持续发展的问题之一。由于根结线虫体积小，不能人工培养，世代长等难于进行体外与宿主的相互作用方面的研究，进展一直很缓慢。1998年在秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)上发现了RNAi沉默现象，并于同一年完成全基因组测序，人们对C.elegans的关注度越来越高。随着RNAi机制的明确和应用技术的逐渐成熟，大规模、高通量鉴定C.elegans全基因组的功能逐渐展开。若能利用C.elegans的信息资源为研究根结线虫服务，将大大推动相关技术的发展。本文利用生物信息学技术对根结线虫的ESTs库和C.elegans的全基因组蛋白库进行了比对，得到一批有用的数据，为大规模确定植物寄生线虫基因功能奠定了基础。主要研究结果如下： 1.利用温室条件，改进高效培养和收集根结线虫J2幼虫的方法，为后续大规模使用线虫材料提供了保障。实验证明采用改进的贝尔曼漏斗法，把纱布换成60目筛网，在筛网上铺一层面巾纸，可以使线虫通过而把杂质隔离开，能够最大程度地减少线虫收集的损失。 2.采用生物信息学分析鉴定物种基因功能的方法。本研究利用充分的网络数据资源和现代生物信息学技术，比对了根结线虫ESTs库2455条序列和C.elegans的基因组蛋白库23212条序列，得到444个同源性很高的序列。结合比较基因组学和功能基因组学分析两个物种基因信息，从而推测南方根结线虫(Meloidgyne incognita)的基因功能，相比经典遗传学，此法可大规模预测物种的基因功能。然后根据C.elegans RNAi效果挑选具有胚致死效应序列进行功能验证。所选基因要符合两个条件才能做交叉干扰：第一，该基因序列与模式线虫至少有连续的21-23 nt的精确匹配；第二，几百个碱基内该序列与模式线虫的基因同源性要高于60％。因此，我们选择了其中4个具有胚致死效应基因的片段进行交叉RNAi功能鉴定。 3.应用并证实了物种间“交叉干扰RNAi”技术。我们通过构建载体，把4个Mincognita基因片段插入到表达dsRNA的载体LITMUS 28i中，通过IPTG诱导体内合成dsRNA，干扰C.elegans。RNAi基因沉默技术相比传统基因敲除技术，具有大规模、高效、快捷、省时省力、容易观察等优势，是传统方法不可比拟的。结果发现此4个基因在不同程度上对C.elegans的胚胎形成和阴门有一定影响。这表明，靶标基因在线虫胚胎发育阶段起重要作用。 4.为了更明确此4个M.incognita基因片段的功能，本文采用1％的间苯二酚作为刺激物，体外转录合成dsRNA浸泡M.incognita J2幼虫。6h摇床悬浮浸泡后，可观察到处理线虫活性明显降低，再次证明沉默此4个基因片段对M.incognita具重要影响。由此证明本研究采用生物信息学技术分析基因功能的方法切实可行，为大规模鉴定物种全基因组功能提供了新的思路。本实验发现线虫长时间聚集容易死亡，采用摇床培养悬浮线虫溶液，大大改善了这一状况。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1南方根结线虫及其危害

1.1.1分类地位

1.1.2形态特征

1.1.3起源与分布

1.1.4侵染循环

1.1.5寄主范围及为害症状

1.1.6防治

1.2线虫RNAi研究进展

1.2.1秀丽小杆线虫

1.2.2 RNAi干扰

1.2.3 RNAi作用机制

1.2.4秀丽小杆线虫RNAi研究进展

1.2.5根结线虫RNAi研究进展

1.2.6秀丽小杆线虫应用于根结线虫的研究

1.3本论文的研究内容及意义

2南方根结线虫RNAi胚致死效应基因的筛选

2.1南方根结线虫的大量培养与收集纯化

2.1.1材料与方法

2.1.2结果与分析

2.2 RNAi胚致死效应基因的筛选

2.2.1下载秀丽小杆线虫全基因组蛋白库

2.2.2搜集根结线虫ESTs库

2.2.3 blastx比对

2.2.4结果与分析

2.3小结与讨论

3 RNAi胚致死效应基因的功能鉴定

3.1材料与方法

3.1.1供试材料

3.1.2主要试剂和酶类

3.1.3培养基

3.1.4常用试剂配制

3.1.5选定靶标基因片段

3.1.6总RNA提取

3.1.7 cDNA的合成

3.1.8内参检测

3.1.9 4个南方根结线虫基因部分片段的PCR扩增

3.1.10扩增片段的回收、克隆、测序

3.1.11载体构建

3.1.12 HT115菌株电转化感受态的制备

3.1.13连接、转化和筛选

3.1.14秀丽小杆线虫培养及同步化

3.1.1 5 RNAi表型观察

3.2结果与分析

3.2.1 RNA的提取

3.2.2目的基因片段的克隆

3.2.3载体双酶切

3.2.4 4个南方根结线虫基因RNAi表型鉴定

3.2.5 RNAi表型统计

3.3小结与讨论

4浸泡法验证胚致死效应基因功能

4.1材料与方法

4.1.1供试材料

4.1.2主要试剂和酶类

4.1.3 4个南方根结线虫基因部分片段的PCR扩增

4.1.4载体构建

4.1.5质粒提取

4.1.6 T7引物PCR扩增及产物纯化

4.1.7体外转录合成dsRNA

4.1.8 FITC检测线虫的吞噬行为

4.1.9 dsRNA处理线虫

4.2结果与分析

4.2.1 4个南方根结线虫基因片段的PCR扩增

4.2.2合成dsRNA

4.2.3 FITC检测线虫的取食行为

4.2.4 dsRNA对南方根结线虫J2幼虫的影响

4.2.5浸泡RNAi表型统计

4.3小结与讨论

5总结与讨论

参考文献

附录1英文缩略表

致谢