猪链球菌2型部分毒力基因序列测定及血清学调查分析

摘要

猪链球菌2型不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，还可以感染相关人员并致死，是一种重要的人畜共患病病原。近些年来，猪链球菌2型在我国时有暴发流行，严重影响养猪业和社会公共卫生安全。有关猪链球菌2型的病原生态学、流行病学的一些问题尚未完全明了，各地猪群猪链球菌2型的易感水平和猪链球菌2型人际感染风险等研究缺乏必要、充足的依据。为此，我们开展了猪链球菌2型病原学、分子生物学和血清学诊断技术研究，对福建省各地区猪场血清样品的猪链球菌2型抗体水平进行了调查分析，以期为猪2型链球菌病的监控提供科学数据。 本实验对疑似猪链球菌2型的福建分离株进行了菌落、菌体形态学，菌株生化特性、药敏试验和毒力等相关特性的观察、分析，并将其命名为PFJ07。试验结果显示，PFJ07的形态、培养及生化特性基本符合猪链球菌2型的特点，具有β溶血，能在48h内致死小白鼠。 根据猪链球菌2型CPS2J基因序列设计、合成了一对特异性引物，以PFJ07基因组DNA模板，扩增出长度为675bp的特异性条带，所有供试阳性参考菌株扩增出相同的DNA片段，所有非2型猪链球菌和其它阴性参考菌株不产生任何条带。优化了PCR反应条件，分别测定了PCR反应的菌体模板和菌体基因组DNA模板的检测灵敏度，结果表明该检测方法对菌体模板的灵敏度为100cfu，对DNA模板的灵敏度为50pg，方法特异、灵敏，可以直接将菌体用作模板方法十分简便。分析了PFJ07的CPS2J基因675bpDNA片段的序列，证实PFJ07菌株的CPS2J基因核苷酸序列与猪链球菌2型标准菌株CPS2J基因核苷酸序列的同源性高达98-100％，因此确定PFJ07是猪链球菌2型菌株，并命名为SS2PFJ07。这也是首次在福建省发现猪链球菌2型菌株。对SS2PFJ07相关毒力基因MRP与EF进行了检测，并对其序列进行了分析与比较。确定SS2PFJ07的表型为MRP+EF-，确定PFJ07菌株的MRP基因核苷酸序列与猪链球菌2型标准菌株MRP基因核苷酸序列的同源性达88％，这些为猪链球菌2型的毒力测定及免疫学研究奠定了基础。 采用商品化的猪链球菌2型血清抗体检测试剂盒，对来自福建省9个地区，77个猪场，1347份血清样品进行了调查分析。结果表明各个猪场群体血清抗体阳性率差异很大，阳性率范围从0％至94％；各地区阳性猪场数范围从22-100％不等；检出阳性猪场时占检测猪场总数的53％。结果提示，福建养猪场存在猪链球菌2型菌株的疫源地，部分猪场存在猪链球菌2型感染的可能，全省各地存在发生猪链球菌2型感染的风险。 以上研究结果为建立猪链球菌2型感染的快速检测方法奠定了技术基础，为我省猪链球菌2型疫情预测、预警提供了十分有价值的数据和材料，为兽医部门制订猪链球菌2型疫病措施提供了有参考价值的资料。

目录

声明

前言

第一部分 猪链球菌病研究进展

1.1 猪链球菌病原学

1.1.1形态及结构

1.1.2生长及培养特性

1.1.3分类

1.1.4对环境抵抗力

1.2流行病学特征

1.2.1国内流行情况

1.2.2流行特征

1.2.3自然感染部位

1.2.4传染源

1.2.5传播途径

1.3致病机理

1.4毒力因子

1.4.1荚膜多糖

1.4.2溶菌酶释放蛋白

1.4.3胞外因子

1.4.4溶血素

1.4.5粘附素

1.4.6其它毒力蛋白

1.5检测方法

1.5.1微生物学检测方法

1.5.2血清学检测方法

1.5.3分子生物学检测方法

1.6临床症状及病理变化

1.6.1猪链球菌病的临床症状

1.6.2猪链球菌病病理变化

1.7猪链球菌病防制

1.7.1预防措施

1.7.2治疗

第二部分 猪链球菌2型的分离与鉴定

1 材料

1.1病料

1.2实验动物

1.3试剂

1.4主要仪器

2 方法

2.1病原菌分离及相关特性分析

2.2猪链球菌2型PCR方法的检测

3 结果

3.1病原菌分离及相关特性分析

3.2猪链球菌2型PCR鉴定

4 分析与讨论

第三部分 猪链球菌2型部分毒力基因PCR检测及序列分析

1 材料

1.1菌株

1.2质粒

1.3试剂

1.4主要仪器

2 方法

2.1猪链球菌2型CPS2J部分基因片段PCR检测方法的建立

2.2猪链球菌2型CPS2J部分基因片段序列测定

2.3猪链球菌2型MRP部分基因片段检测方法的建立

2.4猪链球菌2型MRP部分基因片段序列测定

2.5猪链球菌2型EF部分基因片段PCR检测方法的建立

3 结果

3.1猪链球菌2型CPS2J部分基因片段PCR检测方法的建立

3.2CPS2J基因的克隆、鉴定

3.3CPS2J基因片断序列测定及同源性比较

3.4MRP基因的克隆、鉴定

3.5MRP基因片断序列分析

3.6EF基因PCR检测结果

4 分析与讨论

第四部分 福建省猪链球该菌2型血清学调查分析

1 材料

1.1主要试剂

1.2血清样品

1.3主要仪器

2 方法

2.1猪链球菌2型抗体检测试剂盒操作步骤

2.2福建省猪链球菌2型样品测定

3 结果

3.1福建省各地采集的待检猪血清样品的代码与编号

3.2福建省各地区及兽医院样本检测结果

3.3福建省各地区血清猪链球菌2型抗体阳性率

3.4福建省各地区猪链球菌2型血清抗体阳性猪场的比例

4 分析与讨论

第五部分 结论

附录

参考文献

致谢