甘薯水溶性糖蛋白的分离及高效凝胶色谱测定方法研究

摘要

糖蛋白是一类结构复杂的高分子化合物，具有多种生物活性，在生物体内起着重要作用。本论文以甘薯为原料，采用色谱、凝胶电泳和红外扫描等技术对甘薯水溶性糖蛋白的分离纯化、理化性质及结构进行了研究；同时以牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖标样(DT70)和提取的甘薯水溶性糖蛋白等为样品建立了高效凝胶色谱分离(HPGC)、二极管阵列检测器(DAD)和蒸发光散射检测器(ELSD)串联测定水溶性糖蛋白的方法。 结论： (1)通过单因素试验和正交试验确定了甘薯水溶性糖蛋白的最佳提取条件：料液比为1：25、提取温度为40℃、提取时间为1h、pH为9，蛋白提取率为2.49％。该水溶性糖蛋白为白色絮状，易溶于水，难溶于甲醇，乙醇、丙酮等有机溶剂；分子量为66，000Da；蛋白质含量为88.23％，糖含量为11.75％；它含有非淀粉类多糖，乙酰氨基、吡喃糖环以及α型糖苷键。β-消除反应后，紫外扫描显示在240nm处有明显的吸收峰，说明其为O-糖蛋白。0.1um孔径的滤膜可将甘薯水提取物中的大部分糖蛋白截留。甘薯水溶性糖蛋白体外生物活性实验表明：它具有较好的抗脂质过氧化作用。 (2)采用HPGC-DAD-ELSD串联检测水溶性糖蛋白的色谱条件为：纯水做流动相，流速为0.5ml/min，柱温温度为30℃，漂移管温度为80℃，载气压力为0.35Psi。 (3)采用HPGC-DAD-ELSD串联对BSA和DT70定性、定量分析表明：对非结合态蛋白和多糖而言，经HPGC分离后，虽然ELSD色谱图上显示两个色谱峰，但是根据DAD色谱图有无色谱峰及保留时间，可以对BSA和DT70进行定性判定。定量分析表明，BSA在280nm时，峰高和浓度取对数得的线性方程的相关系数最高：R2=0.9999，公式为：LogA=0.9488LogC+3.4377；在ELSD色谱图上峰面积和浓度取对数的线性方程的相关性较好：R2=0.9981，公式为：LogA=1.3649LogC+6.6932。DT70在ELSD色谱图上峰高和浓度取对数的线性方程相关性较好：R2=0.999，公式为：LogA=0.9139LogC+6.2925。BSA和DT70的加标回收率在95％～103％范围内，最小检测限分别为50ng，24ng，精密度较好，变异率均较小。检测器串联先后顺序导致牛血清白蛋白在ELSD色谱图上保留时间比DAD色谱图上保留时间滞后0.13s。 (4)HPGC-DAD-ELSD串联对纯化甘薯水溶性糖蛋白定性、定量分析表明：经HPGC分离后在DAD和ELSD色谱图上都仅得到一个色谱峰，说明该物质是蛋白和糖共价结合态。甘薯水溶性糖蛋白在给定的浓度范围内，在DAD色谱图上215-225nm峰高差与浓度取对数所得线性方程为：LogA=1.4051LogC+1.124，ELSD色谱图上峰面积与浓度的线性方程为：y=2E+09x-5E+06，相关系数分别为R2=0.9998和R2=0.9982，均大于0.99，线性关系良好。甘薯水溶性糖蛋白加标回收率在92％～103％范围内。其最小检测限为18ng。该方法的精密度较好，变异率较小。甘薯水溶性糖蛋白在ELSD色谱图上的保留时间相对于DAD色谱图上的滞后0.13s。 此外HPGC-DAD-ELSD串联可以直观反映脱蛋白效果，并可对制备的水溶性多糖的纯度做进一步验证。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引 言

1糖蛋白

1.1糖蛋白的生物活性

1.2糖蛋白的结构

1.3糖蛋白的制备

1.4糖蛋白的鉴定方法

2甘薯糖蛋白

2.1甘薯

2.2甘薯糖蛋白的研究现状

3色谱技术

3.1高效液相色谱

3.2高效液相色谱的检测器

3.3双检测器串联的基础

4蛋白质的定量

5超滤

6研究的意义

第一章甘薯水溶性糖蛋白的分离

1实验部分

1.1仪器与材料

1.2实验方法

2结果与讨论

2.1甘薯水溶性糖蛋白性质

2.2甘薯水溶性糖蛋白提取条件的研究

2.3 Sevage法脱蛋白

2.4甘薯水溶性糖蛋白的柱层析纯化

2.5甘薯水溶性糖蛋白纯度的凝胶电泳鉴定

2.6甘薯水溶性糖蛋白红外光谱分析

2.7甘薯水溶性糖蛋白糖肽键特征分析

2.8超滤对蛋白和糖的截留

2.9截留浓缩液的柱层析分析

2.10体外抗脂质过氧化

3 结论

第二章高效液相色谱-双检测器测定水溶性糖蛋白的条件

1实验部分

1.1仪器与材料

1.2实验方法

2结果及讨论

2.1流动相对测定的影响

2.2流速对测定的影响

2.3柱温对测定的影响

2.4漂移管对测定的影响

2.5载气压力对测定的影响

3结论

第三章高效凝胶色谱-双检测器检测对牛血清白蛋白和葡聚糖的定量分析

1实验部分

1.1仪器与材料

1.2实验方法

2结果与讨论

2.1 BSA的HPGC-DAD-ELSD定性分析

2.2 DT70的HPGC-DAD-ELSD定性分析

2.3混样的HPGC-DAD-ELSD定性分析

2.4蛋白检测的最佳波长

2.5 BSA的DAD线性方程

2.6 BSA和DT70的ELSD线性方程

2.7牛血清白蛋白和葡聚糖回收率

2.8方法精密度

2.9最小检测限的测定

2.10滞后时间

3结论

第四章高效凝胶液相色谱仪-双检测器测定甘薯水溶性糖蛋白的方法

1实验部分

1.1仪器与材料

1.2实验方法

2结果与讨论

2.1HPGC-PDA-ELSD对甘薯水溶性糖蛋白的测定

2.2甘薯水溶性糖蛋白检测的最佳波长

2.3甘薯水溶性糖蛋白的线性方程

2.4甘薯水溶性糖蛋白的回收率

2.5方法精密度

2.6甘薯水溶性糖蛋白的最小检测限

2.7滞后时间

3结论

第五章高效凝胶色谱-双检测器检测的应用

1实验部分

1.1仪器与材料

1.2实验方法

2结果及讨论

2.1 HPGC-DAD-ELSD对混合样的测定

2.2 HPGC-DAD-ELSD对未纯化的甘薯水溶性糖蛋白的测定

2.3 HPGC-DAD-ELSD对一次纯化的甘薯水溶性糖蛋白的测定

2.4HPGC-DAD-ELSD对脱蛋白样品的测定

2.5 HPGC-DAD-ELSD对丹参多糖的测定

3结论

参考文献

致 谢