豆豉溶栓酶基因的克隆表达及其体外进化研究

摘要

血栓病是严重危害人类健康的疾病之一，由血栓症引起的心，脑血管疾病在死亡率的排名中居二、三位，这就使得溶栓药物以及具有溶栓功能的保健食品的研制得到迅速发展。微生物溶栓酶作为一种新的溶酶，在理论和临床上都有一定的应用价值，并对我国医药生物技术发展具有积极意义。本实验室已经成功地从豆豉中分离筛选到一株溶栓酶活力高的菌株，并命名为枯草芽孢杆菌LD-8547。 本试验通过PCR从豆豉中筛选出来的产豆豉溶栓酶的枯草芽孢杆菌中扩增豆豉溶栓酶的编码基因片段，连接到pET-28a(+)载体上，再转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌中。将阳性克隆子用IPTG进行诱导表达。结果表明：成功构建了重组菌E.coli BL21/pET28a-fe。诱导表达后，将表达好的菌液进行超声破碎，上镍柱纯化后进行酶活检测，结果表明显示 E. coli BL21/pET28a-fe表达的蛋白有溶栓酶的活性。对E.coli BL21/pET28a-fe进行SDS-PAGE分析显示，在E.coli BL21/pET28a-fe中有两条蛋白带，其大小分别为60 kDa和28 kDa，对比细胞破碎后沉淀和上清中的条带可以发现，60 kDa的蛋白只存在与细胞破碎后的沉淀中，而在上清中没有发现，而28 kDa的蛋白在沉淀和上清中都有存在。 为了提高重组溶栓酶的活力，本试验通过易错PCR和交错延伸技术对豆豉溶栓酶的编码基因进行了改造。并将得到的突变基因连接到pET-28a(+)载体上，再转化到E.coil BL21(DE3)宿主菌中，对得到的重组菌进行两步筛选，结果筛选到4株相对于出发菌株酶活显著提高的重组菌。为了将突变酶和野生酶进行比较，以枯草芽孢杆菌的发酵液为材料，对豆豉溶栓酶进行了分离纯化，并对得到的野生酶和突变酶分别进行了动力学分析。动力学分析表明，得到的四种突变酶的Km值和野生酶的Km相近，而Mut1的Km值小于野生酶的Km，说明相对于野生酶，Mut1对底物的亲和力有了稍许提高。与野生酶的Kcat进行比较，四个突变酶的Kcat值都有所提高，说明对底物的催化能力得到了提高。而与野生酶的Kcat/Km相比，Mut1，Mut2，Mut3，这三个突变酶的Kcat/Km值都有所提高，说明它们对底物的催化能力相对于野生酶来说得到了一定的提高。但Mut4的Kcat/Km相对于野生酶却又一定程度的下降，主要是由于它的Km过高，可能是由于该酶对底物的亲和力下降所致。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写表

声明

1.前言

1.1溶栓酶的研究背景

1.1.1血栓形成及机制

1.1.2血栓对机体的影响

1.1.3血栓治疗进展

1.2豆豉溶栓酶的研究现状

1.2.1溶栓酶的产生菌种

1.2.2溶栓酶的分离纯化

1.2.3溶栓酶的生化特性

1.2.4溶栓酶的生物学功能

1.2.5溶栓酶的分子生物学研究

1.3定向进化

1.3.1定向进化的概念

1.3.2定向进化的原理

1.3.3定向进化的策略

1.3.4筛选

1.4本实验的研究意义及应用前景

2.豆豉溶栓酶基因的克隆表达

2.1试验材料

2.1.1菌株

2.1.2培养基

2.1.3试剂与仪器

2.2实验方法

2.2.1酶活测定方法

2.2.2枯草芽孢杆菌LD-8547基因组的提取

2.2.3目的基因的PCR

2.2.4质粒小量提取

2.2.5表达载体的构建

2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)

2.2.7连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

2.2.8重组质粒验证

2.2.9转化子的诱导

2.2.10重组蛋白的纯化

2.2.11 SDS-PAGE及酶活测定

2.3实验结果

2.3.1表达载体pET28a-fe的构建

3.3.2蛋白的表达及酶活分析

2.4小结与讨论

3.豆豉溶栓酶基因的体外进化

3.1试验材料

3.1.1菌株

3.1.2培养基

3.1.3试剂与仪器

3.2实验方法

3.2.1溶栓酶活性测定及蛋白含量测定

3.2.2质粒的提取

3.2.3目的基因的PCR

3.2.4易错PCR

3.2.5琼脂糖凝胶中DNA片段的回收纯化

3.2.6交错延伸

3.2.7重组质粒的构建

3.2.8 转化

3.2.9重组子的筛选及初步鉴定

3.2.10动力学分析

3.3实验结果

3.3.1目的基因的易错PCR

3.3.2目的基因的交错延伸

3.3.3突变酶的初步筛选

3.3.4突变酶的进一步筛选

3.3.5突变酶的动力学分析

3.4讨论

3.4.1米氏常数的分析

3.4.2反应常数的分析

3.4.3催化效率的分析

参考文献

附录

致谢