豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中的表达

摘要

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是食品微生物的重要成员。由于它对人和动物健康有益，因此它在食品及医药工程领域具有重要应用前景。乳酸菌中存在大量染色体外的遗传物质，为其克隆载体系统的发展提供了极好的材料。近10多年来，随着乳酸菌内源性质粒的去除和电穿孔技术的建立以及乳酸菌中表达信号的分离，已建立和发展了一系列具有不同用途的乳酸菌载体和受体系统。这些载体包括克隆载体、整合载体及表达载体，而食品级基因表达载体的研究则是近年来该领域的前沿和热点。食品级表达载体利用食品级的选择标记替代了传统的抗生素抗性选择标记，这就避免了将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内。因此，乳酸菌食品级载体的研究与开发具有重要意义。 本研究以LacF基因为选择标记，构建了乳酸杆菌食品级表达系统，并进而实现了豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中的表达。首先以pRY300为出发载体，构建了含有Latobacillus caseiATCC393乳糖操纵子LacF和LacG片段的整合型表达载体pRVGF。利用T4DNA聚合酶消除pRVGF中LacF基因的Sph I位点，构建了LacF基因编码区移码突变的质粒pRVGAF，并将其电导入．L．casei ATCC393中。通过与L．casei ATCC393乳糖操纵子之间的同源双交换，筛选到了LaeF<'->基因突变的受体菌株L．casei MBL25(LacF<'->)，并经PCR和Lae表型所验证。利用乳酸杆菌乳糖操纵子基因启动子构建了自主复制型载体pIAbeta-plac。将豆豉溶栓酶不同肽段编码序列分别插入到整合型载体和复制型表达载体中，共构建了6个豆豉溶拴酶基因的表达质粒。将重组表达质粒pRVGF-BADFE(含豆豉溶栓酶成熟肽编码序列电转化L．casei MBL25后，筛选到所需的菌株MBL26。PCR分析结果显示，豆豉溶栓酶基因已经整合到L.casei MBL26染色体中，Lac<'+>表型也得到恢复。表明L.caseiMBL25中LacF基因的功能能被质粒pRVGF-BADFE上的LacF基因互补。L.caseiMBL26经0.5％乳糖过夜诱导后，SDS-PAGE电泳显示成功表达了28KD大小的豆豉溶栓酶蛋白。

目录

论文说明：图表目录

声明

摘要

1引言

2材料和方法

2.1菌种和质粒

2.2培养基

2.3溶液和缓冲液

2.4实验方法

3结果

3.1乳酸杆菌表达豆豉溶栓酶基因策略

3.2乳酸杆菌表达系统的建立

3.2.1乳酸杆菌乳糖缺陷型突变株(LacF-)的构建

3.2.2乳酸杆菌整合型表达载体的构建与鉴定

3.3豆豉溶栓酶基因在L.casei中的表达

3.3.1溶栓酶基因重组质粒pRVGF-BADFE的构建与鉴定

3.3.2LacF+转化子的筛选和鉴定

3.3.3豆豉溶栓酶基因在L.casei中稳定的表达

3.4乳酸菌复制型表达质粒的构建

4讨论

4.1乳酸杆菌转化方法

4.2选择标记的种类及构建策略

4.3值得注意或改进的地方

小结

参考文献

文献综述：乳酸菌表达系统研究进展

摘要

1.乳酸菌的特点及早期研究工作

2.乳酸菌表达系统中的载体

3.食品级系统的定义和特点

4.乳酸杆菌基因表达系统特点

5.乳酸菌基因表达系统展望

参考文献

致谢

在读期间发表的及待发表的论文情况