红麻光钝感突变体的基因组差异与蛋白质组学研究

摘要

红麻(Hibiscus cannabinus L.)为锦葵科木槿属短日照一年生草本韧皮纤维植物,具有耐环境胁迫能力强、适应性广、纤维产量高、品质好等特性,是我国麻纺和造纸工业的重要纤维原料,但其早花混杂品种严重影响了纤维产量,本研究拟以福红952航天诱变获得的光钝感(对光周期反应不敏感)突变体为材料,在海南表现为三种类型的突变体:现蕾期幼蕾脱落(GⅠ型)、现蕾不开花(GⅡ型)、开花不结实(GⅢ型),分别从植物生理学、基因组差异、蛋白质组学研究突变体光钝感且短光诱导不育的遗传规律。研究结果如下：
　　 ⑴红麻光周期观察:红麻光钝感突变体2008年冬季在海南自然短日照条件下,155d仍未现蕾开花,而正常品种只需120d左右即可现蕾开花。2009年7月4日在福州对红麻光钝感突变体材料进行12h的短日照处理,结果表明处理20d后对照福红952开始现蕾,而突变体30d后开始现蕾,即现蕾时间推迟大约10d左右。
　　 ⑵以红麻品种福红952经航天诱变获得的光钝感突变体与光敏感红麻细胞质保持系L23B品种杂交,在海南130d短日照条件下诱导了花蕾的分化发育,即突变体中出现了幼蕾的黄化脱落、现蕾不开花、开花不结实三种类型,观察其分离情况,F2代群体光敏感与光钝感植株的分离比例为3:1分离,说明光钝感与光敏感性状存在一对基因的遗传差异,光周期钝感性状为隐性遗传,该研究结果可为进一步开展红麻光钝感的基因克隆及分子机理研究提供重要的遗传材料。
　　 ⑶分别测定在人工短日照光周期处理的光钝感红麻与对照福红952三个不同时期的叶片可溶性糖、可溶性蛋白、可溶性氨基酸含量的动态变化,结果表明,随着红麻从一裂叶、三裂叶、五裂叶三个不同时期的发育,叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白、可溶性氨基酸均呈现低、高、低的变化规律,对照福红952变化幅度均大于光钝感植株,表明红麻光钝感在光周期诱导下表现出的光周期不敏感特性与其叶片内的生理代谢密切相关。
　　 ⑷从24个多态性较好的RAPD引物中筛选到3个引物可以把红麻光钝感突变体与对照品种区分开来,获得4条特异条带,测序表明这四个片段大小分别为612bp、723bp、743bp、1178bp,为进一步开发SCAR标记奠定实验基础。
　　 ⑸应用在其他高等植物开发的8对mtDNA(线粒体DNA)特异引物,对红麻光钝感突变体线粒体基因非编码区DNA序列进行PCR扩增。结果表明选用的8对引物能扩增线粒体基因间隔区和内含子区域,并只检测到2个变异位点,说明mtDNA在红麻光钝感突变体与亲本之间相当保守。
　　 ⑹应用8对cpDNA(叶绿体DNA)通用引物对红麻光钝感突变体及相近的红麻品种的叶绿体基因组非编码区DNA序列进行PCR扩增。共扩增植物cpDNA约13kb,占其叶绿体基因组8.1％。扩增产物分别应用4种限制性内切酶(EcoRⅠ HindⅢ、TaqⅠAulⅠ)酶切,1.5％琼脂糖电泳检测结果表明:cpDNA在红麻光钝感突变体与正常品种比较,均能扩增出条带,大小在1.5kb-2.0Kb之间,说明所选用的通用引物可用于红麻叶绿体基因组DNA研究,将PCR扩增产物进行酶切,每个片段均有相同的酶切位点,仅cp4引物的PCR扩增产物用AluⅠ内切酶酶切得到多态片段,但突变体与亲本之间未发现叶绿体基因组DNA发生变异。上述结果表明,红麻光钝感突变发生在基因组DNA上,与线粒体与叶绿体的基因组DNA无关。
　　 ⑺以红麻光周期不敏感(光钝感)突变体的开花期与正常品种福红952叶片为材料,首先建立并优化蛋白质双向电泳研究体系,即采用蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术,在样品制备、不同的蛋白质上样量及染色方法等方面进行了比较研究,研究结果表明:(1)红麻叶片TCA丙酮法比苯酚抽提法提取效率高且蛋白齐全,其中TCA-丙酮法蛋白提取率为20.56％,苯酚抽提法提取效率为4.90％。(2)蛋白质干粉的裂解液中加入0.2M硫脲后可以获得更多的蛋白质差异点,这些差异点主要为碱性蛋白。(3)分别利用银染和考马斯亮蓝染色对第二向SDS-PAGE胶进行染色,结果表明,银染灵敏度最高,但可重复性差,考马斯亮蓝G250比R250染色方法更灵敏,因此建议使用考马斯亮蓝G250,可以获得理想的结果。(4)利用上述改良后的方法提取红麻福红952与光钝感红麻叶片总蛋白,进行双向电泳,对染色后的胶体图片利用PDQUEST软件进一步对双向电泳产生的2-DE蛋白质图谱进行比较分析,获得9个差异的蛋白质点,其中2个核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶,质体转酮酶,果糖1,6-磷酸醛缩酶,热激蛋白共5个点在品种福红952中出现,而在突变体中表现为蛋白表达量下调,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基在突变体中表现为蛋白表达量上调,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(spot2)和一个未知蛋白(spot7)只在突变体中出现,H+-ATP合成酶(spot4)只在品种福红952的参照中表达,而在突变体中缺失,这些差异蛋白可能与红麻对光的敏感度有关。为红麻光钝感蛋白质组学功能基因组序列分析研究奠定实验基础。