海鲈鱼胶原蛋白肽的制备分离及对皮肤伤口的愈合作用

摘要

海鲈鱼是广东省产量最高的海洋经济鱼类，在其加工过程中会产生大量鱼皮、鱼头、鱼骨等富含胶原蛋白的副产物，目前其主要用于制作鱼粉和肥料，利用率不高。通过精深加工将其制备成为胶原蛋白肽，既可显著提高其附加值，又可避免资源浪费和环境污染。近年来，对胶原蛋白肽的活性研究主要集中于抗氧化、降血压和抑菌等生物活性方面，而对其促进伤口愈合的活性研究较少。为此，本文以海鲈鱼加工副产物为原料制备胶原蛋白肽并分离不同组分，建立创伤动物模型评价其促进皮肤伤口愈合的效果，比较不同组分的理化与功能特性差异，在分子和细胞水平上探明其促进皮肤伤口愈合的生物机制，为开发创伤患者专用临床营养品的胶原蛋白肽配料提供依据。主要研究结果如下：
　　（1）海鲈鱼胶原蛋白肽的酶法制备工艺优化：采用海鲈鱼加工副产物为原料，以胶原蛋白肽提取率为优化指标，通过单因素试验结合Box-Benhnken中心组合试验设计优化酶法制备海鲈鱼胶原蛋白肽工艺，建立了包括碱性蛋白酶与底物浓度比、酶解温度、酶解时间和pH值的四因素回归模型。经过回归分析和验证试验，确定酶解的最佳工艺条件为：碱性蛋白酶与底物浓度比2.33％、酶解温度47℃、酶解时间2.5h和pH值9.0。在此优化条件下胶原蛋白肽提取率为48.65%，并且这四个因素对胶原蛋白肽提取率的影响效果大小排序为时间>酶与底物浓度比>温度>pH值；通过基质辅助解吸飞行时间质谱仪测定出最优条件下制得的胶原蛋白肽的分子量主要分布在1342.684~3346.747Da之间。
　　（2）海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口的愈合作用研究：以切除型小鼠皮肤伤口为模型，研究不同浓度的海鲈鱼胶原蛋白肽（低剂量：0.2g·kg-1·bw-1；中剂量：0.66g·kg-1·bw-1；高剂量：2g·kg-1·bw-1）对小鼠皮肤伤口愈合作用的影响。结果表明：低剂量的海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口愈合作用不显著；中、高剂量的海鲈鱼胶原蛋白肽均能显著提高小鼠皮肤的伤口愈合率（p<0.05）；通过Masson染色和H&E染色发现中、高剂量海鲈鱼胶原蛋白肽均能显著促进伤口组织中胶原沉积（p<0.05），减少伤口组织中的炎症反应；同时通过免疫组化染色发现中、高剂量海鲈鱼胶原蛋白肽均能显著促进伤口组织中IGF-1和FGF-2表达（p<0.05）；中剂量的海鲈鱼胶原蛋白肽促进小鼠皮肤伤口的愈合作用优于高剂量。从体内角度揭示了SBCP对皮肤伤口的愈合有促进作用。
　　（3）海鲈鱼胶原蛋白肽及其组分对NIH/3T3细胞增殖和迁移的影响：比较三种蛋白酶（胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶）制备的海鲈鱼胶原蛋白肽对NIH/3T3细胞增殖的影响。结果表明：碱性蛋白酶制备的海鲈鱼胶原蛋白肽促进NIH/3T3细胞增殖的活性最好，因此采用碱性蛋白酶来制备海鲈鱼活性胶原蛋白肽并优化其制备工艺。碱性蛋白酶制备的海鲈鱼胶原蛋白肽经2kDa和3kDa的超滤膜分离得到三种组分SBCP1（MW<2000Da）、SBCP2（2000Da3000Da）。以NIH/3T3细胞为模型，比较SBCP1、SBCP2和SBCP3对NIH/3T3细胞增殖和迁移的影响。结果表明：三种海鲈鱼胶原蛋白肽组分均能促进NIH/3T3细胞增殖，其中SBCP1促进NIH/3T3细胞增殖活性的最好，其在100μg·mL-1时NIH/3T3细胞有最大增殖率为28.42%；且通过划痕试验发现SBCP1还能显著促进NIH/3T3细胞的迁移（p<0.01）。从体外角度揭示了SBCP对皮肤伤口的愈合有促进作用。
　　（4）海鲈鱼胶原蛋白肽组分的理化、功能特性及氨基酸组成分析：比较三种海鲈鱼胶原蛋白肽组分（SBCP1、SBCP2和SBCP3）的水合性质、溶解性、吸油性、起泡性及乳化性等理化、功能特性以及氨基酸组成。结果显示：随着海鲈鱼胶原蛋白肽组分的分子量增大，其吸水性和溶解性均呈降低的趋势，其持水性、乳化性和乳化稳定性以及起泡性和泡沫稳定性均呈升高的趋势；中等分子量的海鲈鱼胶原蛋白肽组分SBCP2的吸油性显著高于SBCP1和SBCP3两个组分（p<0.05）；SBCP1、SBCP2和SBCP3的苯丙氨酸含量分别为15.21%、8.60%和8.73%，赖氨酸含量分别为7.87%、4.10%和4.20%，海鲈鱼胶原蛋白肽组分中苯丙氨酸与赖氨酸含量的差异可能与其促进NIH/3T3增殖的活性差异有关。

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第一章 前言

1 海洋胶原蛋白肽的概况和生物活性

2 皮肤伤口愈合的生物机制及试验模型

3 胶原及其衍生物促进伤口愈合的研究进展

4 本课题立题背景和意义、主要研究内容及试验方案

第二章 海鲈鱼胶原蛋白肽的酶法制备工艺优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口的愈合作用研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 海鲈鱼胶原蛋白肽及其组分对NIH/3T3细胞增殖和迁移的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 海鲈鱼胶原蛋白肽组分的理化、功能特性及氨基酸组成分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 结论

1 结论

2 创新点

参考文献

致谢