草珊瑚叶片cDNA文库构建及EST分析

摘要

草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.) Nakai是金栗兰科草珊瑚属(Sarcandra)常绿半灌木，是一种传统的中草药。本研究从草珊瑚的本草考证、生物学特征、资源概述、化学成分、药理作用及草珊瑚研究现状这6个方面进行了综述。草珊瑚的研究多集中于栽培技术、化学成分、质量控制、种质资源遗传多样性等方面，而对于深层次的分子克隆、代谢途径及蛋白功能的研究鲜有报道，有待于进一步探究。本研究以适宜的草珊瑚叶片总 RNA提取方法为基础，构建了草珊瑚叶片的cDNA文库并进行了初步的生物信息学分析。主要研究内容和结果如下：
　　1、本研究用CTAB法、CTAB-Trizol法、Trizol法、CTAB-LiCl法、天根RNA提取试剂盒法、百泰克RNA提取试剂盒法共6种方法提取草珊瑚叶片的总RNA。研究结果表明：采用天根试剂盒快速提取草珊瑚叶片总RNA，提取的总RNA能达到试验要求；同时CTAB-LiCl也是一种选择，只是时间较长、过程相对繁琐，其它4种方法不适合提取草珊瑚叶片总RNA。
　　2、将提取的符合要求的草珊瑚叶片总RNA进行cDNA文库的构建，在合成cDNA的过程中，对ds cDNA的起始材料、最优循环数和载体连接比例进行了优化。分别确定了ds cDNA合成的起始材料是第一链原液2μL，第18循环为最优循环，载体与 cDNA的最佳连接比例是1:1.98，文库滴度为1.14×107cfu·mL-1，检测到插入的片段大小在500～3000bp之间，平均约1000bp，扩增后的文库平均滴度是0.94×108cfu·mL-1。
　　3、经测序共得到177个有效的EST序列，GC的含量为41.9％，平均长度790bp；对177条序列进行拼接与聚类，共得到151条单一序列(unigene)，其包含有12个片段重叠群(contig)及139个单基因(singleton)，文库的冗余度为14.7%。草珊瑚叶片中低丰度表达的基因有139条(92.05%)；中丰度表达的基因有10条(6.62%)；高丰度表达基因有2条(1.32%)。对151条单一序列进行同源性分析和序列比对。有32条(21%)无同源性，是新序列；119条(79%)有同源性，包括24条已知功能的蛋白和91条的预测蛋白，而未知蛋白有4条(3%)。
　　5、用 Blast2GO、KEGG软件进行相关基因功能注释和代谢通路分析。119条 unigenes在blast2GO共获得了415个GO terms，并且将其归结为3类：生物学过程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)、细胞组件(Cellular Component)。生物学过程共185个GO terms，占44.85%；分子功能有104个GO terms，占25.06%；细胞组件则有126个GO terms，占30.36%。
　　共获得具有KEGG注释的序列有50条。获得KEGG注释的50条序列根据BRITE功能等级分类，共统计出：有29条序列信息与代谢相关，有19条序列与遗传信息加工有关，有10条序列属于环境信息加工方面的内容，有11条是参与细胞过程的序列，有25条相关序列信息属于生物体系统的范畴，而属于人类疾病相关的序列信息有32条，共126条。
　　6、物种相似性分析方面，草珊瑚叶片与莲花的相似性最高，但并没有检测到与同属植物的相似性，说明本属植物基因组、转录组及蛋白组方面的研究较少。

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1 引言

1.1 草珊瑚的研究概况

1.2 全长cDNA文库的构建及应用

1.3 表达序列标签(EST)

1.4 药用植物次生代谢物在功能基因组学上的研究进展

1.5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 主要试验设备

2.3 主要试剂

2.4 RNA提取

2.5 全长cDNA文库的构建

2.6 EST测序与生物信息学分析

3 结果与分析

3.1 总RNA的提取

3.2 cDNA文库结果分析

3.3 EST序列测定及生物信息学分析

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

参考文献

缩略词(Abbreviation)

附录1

附录2

附录3

附图

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致谢