水稻亚细胞定位标记系稳定遗传株系培育及其应用初探

摘要

亚细胞定位，是指某种蛋白质或者表达产物在细胞内的具体存在部位。蛋白质的功能与其所在的亚细胞位置密切相关，而亚细胞定位研究可以为确定某些未知蛋白质的功能提供重要的参考信息。在前期研究中，本课题组已经构建了一套保守性定位于主要细胞器的、且携带有特异性荧光蛋白GFP/RFP融合结构的植物表达载体，并初步获得了转基因水稻材料，其中包含的亚细胞定位类型主要有：细胞膜、细胞核、内质网、质体、线粒体、高尔基体、液泡、过氧化物酶体及细胞骨架。
　　本研究主要内容包括：⑴经过潮酶素抗性筛选、PCR验证、原生质体荧光观察及水稻叶鞘组织荧光观察，验证了绝大多数前期所培育的标记系材料能够稳定表达荧光信号，并且正确定位于预测的细胞器；⑵针对转化pCXSN-RFPAtCCASP、pCXSN-GFPmTn、pCXSN-RFPH2B、pCXSN-RFP等结构的荧光信号弱或未检测到荧光信号的材料，重新构建了以Ubiquitin强启动子替代35S启动子驱动荧光蛋白融合结构表达的载体，并进行了验证；⑶以稳定表达核定位绿色荧光标记GFP-H2B的水稻为例子，将一个水稻转录因子WRKY45-RFP融合表达结构转化到GFP-H2B水稻原生质体中，荧光观察结果显示WRKY45-RFP和GFP-H2B共定位于细胞核中，表明本研究所培育的荧光标记系能够应用于水稻蛋白的亚细胞共定位研究；⑷同样以GFP-H2B水稻为材料，以表达PWL2-mCherry-NLS的稻瘟菌株pBV591侵染GFP-H2B水稻叶鞘组织，荧光观察结果显示， PWL2-mCherry-NLS和GFP-H2B共定位于水稻细胞核中，符合前人关于PWL2-mCherry-NLS在稻瘟菌内表达后被转运到水稻细胞核内的研究结果，同样表明水稻荧光标记系在稻瘟-水稻互作研究具有很好的应用前景。

目录

声明

1. 文献综述

1.1 背景

1.2 前期工作

1.3 植物蛋白亚细胞定位的常用方法

1.4 常见荧光蛋白种类及其在植物研究中的应用

1.5 本研究的目的意义及工作内容

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3. 结果与分析

3.1 转基因植株后代检测

3.2 转基因水稻后代植株原生质体检测

3.3 转基因后代水稻植株叶鞘组织检测

3.4 载体优化

3.5 pCXUN-表达载体原生质体瞬时转化实验

3.6 利用GFP-H2B水稻材料进行WRKY45-mCherry定位分析

3.7 稻瘟菌侵染水稻叶鞘组织及荧光观察

4. 讨论

4.1 优势及创新点

4.2 应用前景

4.3 后续工作

参考文献

附录A 主要试剂与仪器

附录B 常用培养基及溶液配方

附录C 实验方法

附录D 亚细胞定位融合序列比对

致谢