丝瓜PPO基因家族的鉴定及其在褐变中作用的初步研究

摘要

丝瓜(Luffa cylindrical)以其柔嫩多汁的果实和清热解暑的功效深受人们的喜爱，但在烹饪时易发生褐变，大大降低了感官品质、食用价值、商品价值，而且还阻碍产品流通，缩短货架期，甚至严重影响人们的视觉感受和食欲，让消费者无法接受，已成为制约果蔬贮运加工业发展的主要障碍之一。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是引起丝瓜褐变的关键酶，能够在O2的参与下对酚类底物催化氧化成醌，进而导致褐变，从分子生物学角度了解褐变机理并控制褐变的发生已成为果蔬采后研究的热点。本研究在转录组测序基础上，以普通丝瓜为材料，通过RT-PCR方法获得丝瓜PPO基因家族成员，利用qPCR（实时荧光定量扩增检测）方法测定丝瓜组织器官、品种、贮藏期、以及鲜切放置时间下PPO基因的表达变化，分析PPO基因表达、酶活性与褐变之间的关系，初步探讨PPO基因功能及其在丝瓜褐变过程中的作用，同时构建重组载体进行原核表达，为丝瓜PPO蛋白的进一步分离纯化和活性测定提供物质基础和理论支持，也为进一步探讨其功能提供可能。主要结果如下： （1）利用改良消光值法测定了2个有棱丝瓜和6个普通丝瓜品种的褐变度，筛选出褐变度较高的的试验材料，结果表明普通丝瓜比有棱丝瓜更容易褐变，其中普通丝瓜R3褐变度最高。 （2）以普通丝瓜 R3为试验材料，测定其在4℃储藏时间和鲜切25℃室温放置时间处理下的酶活性与总酚含量变化，结果表明：随着采后4℃储藏时间和鲜切25℃室温放置时间的增加丝瓜褐变加重，丝瓜总酚含量先上升，达到一定值后趋于稳定；丝瓜中PPO酶活性总体变化趋势呈先上升后下降。 （3）以普通丝瓜果肉为材料，通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜3个PPO基因，均具有完整的的阅读框(ORF)。LcPPO1基因全长2026 bp，包含一个1794 bp的ORF，编码598个氨基酸；LcPPO2基因全长2071 bp，ORF为1722 bp，编码574个氨基酸；LcPPO3基因全长2189 bp，ORF为1779 bp，编码593个氨基酸。三条PPO基因编码蛋白序列比较同源性为47.5％，全长cDNA序列碱基构成相比同源性为56.4％，且LcPPO1与LcPPO3同源性更高，达到71.7％，在ORF处相似部分分布相对密集。 （4）通过在线分析软件对 LcPPO编码的蛋白进行生物学信息分析得出：三个蛋白均不含信号肽序列，属于亲水性、非跨膜蛋白；LcPPO亚细胞定位于叶绿体；LcPPO具有PPO蛋白的典型特征。同源性分析发现，不同来源PPO在氨基酸序列上具有较高同源性，分析PPO蛋白亲缘关系发现，LcPPO1、LcPPO2和LcPPO3均与黄瓜、甜瓜等聚为一类，蛋白亲缘关系较近，可见不同植物的PPO系统进化关系具有明显的种属特征；三个蛋白的空间结构较相似。 （5）以丝瓜18s rRNA为内参基因，运用qPCR法分析丝瓜褐变相关基因PPO mRNA的表达情况，结果表明：丝瓜PPO基因家族三个基因都具有组织表达特异性，在根、茎、叶、花和果实中都有所表达，LcPPO1、LcPPO2、LcPPO3分别在果实、叶、花中表达量最高；随着采后4℃储藏时间和鲜切25℃室温放置时间的增加，LcPPO1、LcPPO2表达量呈先上升后下降趋势，而LcPPO3基因鲜切后表达量均低于采后当时，期间表达量略有起伏。 （6）LcPPO定量表达量结合酶活性、总酚含量分析，结果表明：在丝瓜4℃低温储藏过程中，3个基因表达量与 PPO酶活性都呈极显著性正相关，相关系数大小为：LcPPO2>LcPPO1>LcPPO3，与总酚含量呈负相关；在丝瓜采后25℃储藏期间下，丝瓜褐变发生明显，丝瓜总酚含量随着储藏时间的增加逐渐上升，LcPPO1表达量与 PPO酶活性呈显著性正相关，LcPPO2表达量与PPO酶活性呈极显著性正相关，LcPPO2基因的表达与酶活性相关性最强，LcPPO3表达量与PPO酶活性相关性不明显。推测LcPPO1和LcPPO2在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用，促进丝瓜酶促褐变的发生。 （7）采用大肠杆菌原核表达体系，将褐变相关性最强的LcPPO2构建到 pET-21d(+)载体质粒，成功获得了高效表达质粒pET-21d-LcPPO2，将pET-21d-LcPPO2转入BL21（DE3）表达感受态细胞，在条件为25℃、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导剂终浓度为0.2 mmol/L时目的蛋白在65kDa开始表达，并且蛋白表达量随着诱导剂浓度的增加而增加，当IPTG终浓度达到0.8 mmol/L时，蛋白表达最多。

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