暗处理对柑橘黄龙病碘-淀粉检测技术影响研究

摘要

柑橘黄龙病是世界范围内危害柑橘生产最严重的病害之一。由于黄龙病田间症状复杂，常会造成误判，如何进行准确诊断将是面对实际生产中急需解决的最现实问题。田间有多种黄化表现形式，在我国，通常以叶基部褪绿为典型症状，在美国，佛罗里达州则以斑驳叶为判断依据。为了阐明基部褪绿叶片和斑驳叶片哪个更具有田间症状诊断依据，以及黄龙病在不同症状中分布情况，本研究首次选用“红鼻子果”树为研究对象，将“红鼻子果”树作为黄龙病标准树，比较柑橘黄龙病在基部褪绿叶片、斑驳叶片以及在不同症状叶片中的分布，为暗处理检测技术提供更全面的采样依据，同时为田间诊断提供技术支持。为了阐明在黑暗条件下不同季节健康奥林达夏橙叶片与感黄龙病奥林达夏橙叶片淀粉含量的变化以指导田间碘-淀粉法检测柑橘黄龙病，本研究将“红鼻子果”树作为黄龙病标准树，健康植株采自无毒苗圃，以夏橙叶片为材料，分别进行T=8:00暗处理0h、24h、48h、72h；T=12:00暗处理0h、24h、48h、72h；T=17:00暗处理0h、24h、48h、72h处理，利用暗处理检测技术以及荧光定量PCR检测技术鉴定不同暗处理的样本，同时进行了碘-淀粉法与暗处理碘-淀粉检测法的比较及暗处理前后显微结构的变化。具体结论如下： 1.黄龙病症状田间分布规律 本研究首先选用南丰蜜橘、纽荷尔脐橙、砂糖橘和奥林达夏橙四个品种的“红鼻子果”树叶片为研究对象，通过实时荧光定量PCR检测基部褪绿叶片和斑驳叶片的黄龙病分布情况。结果表明，南丰蜜橘、纽荷尔脐橙、砂糖橘和奥林达夏橙四个品种的基部褪绿叶片的平均检出率均为100%，南丰蜜橘斑驳叶片的平均检出率为88.89%，纽荷尔脐橙斑驳叶片的平均检出率为88.89%，砂糖橘斑驳叶片的平均检出率为94.44%，奥林达夏橙斑驳叶片的平均检出率为83.33%。这四个品种基部褪绿叶片的检出率均比斑驳叶片的高。 选用奥林达夏橙“红鼻子果”树为研究对象，收集4个季度柑橘叶片，根据不同症状将其分类，通过实时荧光定量PCR检测不同症状的柑橘叶片。结果表明，黄龙病树上，除正常不显症叶片外，其他各种症状的叶片都表现出较高的检出率，叶片均匀黄化症状检出率最高为98.51%，其次是典型斑驳症状叶，检出率为96.13%，缺锌状叶片检出率为100%，而正常不显病叶片的检出率为61.42%。本研究还发现，不同黄化症状在田间存在混合出现的情况。 因此，暗处理检测田间采样时优选基部褪绿叶片，其次为斑驳症状叶片和均匀黄化叶片。 2.不同季节暗处理检测结果 春夏秋冬季节性的更替导致淀粉积累的变化，本文研究这种季节性变化对暗处理检测技术在田间使用的影响，以及田间不同季节条件下暗处理时间的选择，得出其最佳检测季节和暗处理时间。（1）春季晚上17：00采样时暗处理时间对检测结果的影响较大，春季暗处理时间最好为72h，避免晚上采样。（2）夏季检测结果相对稳定，黄龙病植株和健康植株检测均不受暗处理的影响；（3）秋季进行暗处理检测时，早中晚都可以进行，但暗处理时间应达到48h或以上。（4）冬季检测结果与夏季类似，也比较稳定，不受暗处理的影响，这可能是因为冬季气温较低，植株淀粉积累少，暗处理技术对柑橘淀粉积累的影响小。 由此可知，4个季节均可以进行暗处理检测。春季检测早上和中午暗处理72h采样；夏季、秋季和冬季，早上、中午和晚上均可以采样检测，暗处理48h。 3.碘-淀粉法与暗处理检测法的比较及在显微结构下的差异 本研究将暗处理碘淀粉检测技术与碘淀粉检测法进行比较，暗处理碘淀粉检测法与qPCR检测法的一致率显著高于碘-淀粉法与qPCR检测法的一致率，说明采用暗处理碘淀粉检测结果相对较为准确，这也说明暗处理技术是必要的。同时柑橘叶片暗处理前后显微结构的变化结果也显示暗处理的优势，黄龙病叶片暗处理前后，韧皮部均积累大量淀粉，无法“转移”，因此，暗处理前后染色程度都较深，健康叶片则不同，暗处理前韧皮部有淀粉积累，经暗处理后，淀粉由于代谢消耗，叶片中淀粉含量显著减少，因此与暗处理前不同，经碘染色后，不发生颜色变化，结果证明了碘淀粉检测技术中使用暗处理是必要的。

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