转染mA20及其突变体对内毒素血症的影响和hA20突变体研究

摘要

第一部分基于流体动力学转染mA20及其突变体对内毒素血症的治疗作用 目的:研究mA20及其突变体mA20-ZnF4-7质粒对脂多糖(LPS)攻击所致实验性内毒素血症的治疗作用。 方法:用LPS攻击小白鼠制备内毒血症动物模型。将实验动物随机分为：生理盐水组、单纯内毒素组、空质粒组、mA20 质粒治疗组和mA20-ZnF4-7质粒治疗组。按10μg质粒：1.6ml生理盐水比例把质粒溶于生理盐水中，采用基于流体动力学基因转染方法对实验组小鼠进行质粒治疗性注射。以ELISA检测各组血浆TNF-α、IL-1β表达；以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测白细胞中mA20及其突变体mRNA的表达；12小时观察组织病理变化。 结果:(1)mA20 质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的TNF-α在各时间点的表达(pg/ml)分别为：6h：(201.797±4.789)、(235.710±6.108)，12h：(236.580±7.497)、(255.130±7.827)，24h：(154.551±16.460)、(223.246±11.316)；该两组之间无显著性差异(p>0.05)；与单纯内毒素组、空质粒组的TNF-α表达比较有显著性降低(p<0.05)。mA20 质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的IL-1β在各时间点的表达(pg/ml)分别为：6h：(87.103±3.840)、(101.586±2.486)，12h： (83.655±4.973)、(94.460±3.110)，24h：(77.678±6.555)，(87.103±4.826)；该两组之间无显著性差异(p>0.05)；与单纯内毒素组、空质粒组的IL-1β表达比较有显著性降低(p<0.05)；各时间点之间比较无明显差别(p>0.05)。(2)mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的mA20及其突变体mRNA表达与空质粒组、单纯内毒素组、生理盐水组比较有显著性升高(p<0.01)。空质粒组、单纯内毒素组的mA20及其突变体mRNA表达与生理盐水组比较有显著性升高(p<0.05)；各时间点之间比较无明显差别(p>0.05)。(3)病理学观察结果显示：mA20治疗组、mA20-ZnF4-7治疗组的肝、肺损伤均较单纯内毒素组、空质粒组轻；与生理盐水对照组相比，肝、肺损伤无明显差别。 结论:“基于流体动力学的基因转染方法”能有效地把目的质粒DNA 转入肝、肺；对实验性类毒素血症小鼠体外转染mA20-ZnF4-7和 mA20 有相似的治疗作用，这为其临床应用提供一定的实验基础。 第二部分基于流体动力学转染mA20及其突变体对内毒素血症的预防作用 目的:研究 mA20及其突变体mA20-ZnF4-7质粒转染对LPS攻击所致实验性内毒素血症的预防作用。 方法:用LPS攻击小白鼠制备内毒血症动物模型。按10μg质粒：1.6ml 生理盐水比例把质粒溶于生理盐水中，采用“基于流体动力学基因转染方法”对实验组小鼠进行质粒预防性注射。以 ELISA 检测各组血浆TNF-α、IL-1β表达；以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测白细胞中mA20及其突变体mRNA的表达；12小时观察组织病理变化。 结果:(1)mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7 质粒治疗组的TNF-α在各时间点表达(pg/ml)分别为：6h：(211.942±9.133)、(163.536±0.502)，12h：(195.130±26.318)、(206.446±34.797)，24h：(182.963±14.527)、(158.029±19.176)；与空质粒组、单纯内毒素组的TNF-α表达比较有显著性降低(p<0.05)。mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的IL-1β在各时间点表达(pg/ml)分别为：6h：(137.908±4.487)、(138.598±8.733)，12h：(137.678±3.539)、(137.448±7.953)，24h：(129.862±11.602)、(126.873±6.942)；与空质粒组、单纯内毒素组的IL-1β表达比较有显著性降低(p<0.05)；各时间点之间无显著性差异(p>0.05)；(2)mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的mA20及其突变体mRNA 表达与空质粒组、单纯内毒素组、生理盐水组比较有显著性升高。空质粒组、单纯内毒素组的mA20及其突变体mRNA表达与生理盐水组比较有显著性升高；各时间点之间无显著性差异(p>0.05)；(3)病理观察结果显示，mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的肝、肺损伤均较空质粒组、单纯内毒素组轻；与生理盐水组相比，肝、肺损伤无明显差别。 结论:“基于血流动力学的基因转染方法”能有效果地把目的质粒DNA 转入肝、肺，对实验性内毒素血症小鼠体外转染mA20-ZnF4-7和 mA20 有相似的预防作用，这也为临床应用进一步提供一定的实验基础。 第三部分脂质体包裹mA20及其突变体对内毒素血症的治疗作用 目的:研究脂质体包裹 A20 及其突变体mA20-ZnF4-7质粒对LPS攻击所致实验性内毒素血症的治疗作用。 方法:用LPS攻击小白鼠制备内毒素血症动物模型。随机分为：生理盐水对照组(NS组)、单纯内毒素组、空质粒组、脂质体包裹mA20质粒治疗组(L-mA20组)、脂质体包裹mA20A质粒治疗组(L-mA20A组)。采用旋转蒸发法制备脂质体，并按200μl脂质体：10μg 质粒的比例作为每只小鼠的使用量。采用尾静脉注射脂质体包裹质粒的溶液，提取血浆、分离白细胞、留取肝肺；以ELISA检测各组血浆TNF-α、IL-1β表达；以逆转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)检测白细胞中 mA20极其突变体mRNA的表达；并于12小时点观察组织病理变化。 结果:(1)L-mA20组和 L-mA20Δ组的TNF-α在各时间点表达(pg/ml)分别为：6h：(304.696±6.087)、(304.985±6.291)，12h：(321.217±10.579)、(256.580±33.524)，24h：(307.594±11.181)、(280.348±11.698)；与单纯内毒素组、空质粒组的TNF-α表达比较有显著性降低(p<0.05)。L-mA20组和L-mA20Δ组的IL-1β在各时间点表达(pg/ml)分别为：6h：(256.989±3.921)、(263.655±5.645)，12h：(205.724±4.827)、(154.690±1.380)，24h：(165.724±7.772)、(101.816±3.259)；依时间有显著性下降趋势；与单纯内毒素组、空质粒组的IL-1β表达比较有显著性降低(p<0.05)；L-mA20Δ组24h点的IL-1β与6h点比较有显著性降低(p<0.05)；(2)mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的mA20及其突变体mRNA表达与空质粒组、单纯内毒素组、生理盐水组比较有显著性升高。空质粒组、单纯内毒素组的 mA20及其突变体mRNA表达与生理盐水组比较有显著性升高；(3)病理观察结果显示：L-mA20组和L-mA20A组的肝、肺损伤均较单纯内毒素组、空质粒组轻；与NS相比，肝、肺损伤无明显差别。 结论:尾静脉注射脂质体包裹mA20及其突变体mA20-ZnF4-7质粒对内毒素血症小鼠有相似的治疗作用，为临床用脂质体包裹质粒DNA治疗内毒素血症作好铺垫，为临床应用结构更简单的A20蛋白提供了一定实验基础。 第四部分人锌指蛋白A20基因突变提构建及真核表达初步研究 目的:采用分子设计软件设计并构建人锌指蛋白A20基因突变体，转染小鼠RAW264.7真核表达细胞，检测其对LPS刺激的 RAW264.7细胞的抗炎活性。 方法:采用分子设计软件对hA20基因进行分析，把第 332 位到第1778位基因剔除。使用核酸内切酶AccⅢ酶切真核表达质粒pcDNA3-FlaghA20，使其成线性后。再采用DNA连接酶对质粒进行自连反应，将重组子转染JM109，挑取菌落，用PCR和酶切方法鉴定真假阳性克隆。使用小鼠RAW264.7巨噬细胞作为研究对象，并完全随机分为：单纯LPS刺激组、hA20全长质粒组和hA20N-ZnF4-7质粒组。应用Lipofectamine2000 真核转染系统转染 LPS 刺激的RAW264.7细胞，用ELISA 检测细胞培养上清的TNF-α、IL-1β表达变化。 结果:通过PCR、酶切可见部分克隆片段只为923bp，即全长hA20经AccⅢ酶切后的片段；送检测序，显示构建成功；RAW264.7细胞培养上清的TNF-α、IL-1β表达(pg/ml)分别为：单纯 LPS 刺激组：(250.10±60.18)、(221.33±30.02)；hA20 全长质粒组：(120.87±33.75)、(69.21±13.18)；hA20N-ZnF4-7 质粒组：(116.51±22.82)、(63.45±12.73)。 结论：我们成功的构建了hA20突变体质粒 pcDNA3.0-Flag-hA20N-ZnF4-7，其对LPS攻击的RAW264.7细胞有明显的抗炎活性，为后续的进一步真核表达研究作好铺垫。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

研究背景

第一部分基于流体动力学转染mA20及其突变体内毒素血症的治疗作用

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分基于流体动力学转染mA20及其突变体内毒素血症的预防作用

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分脂质体微囊包裹mA20及其突变体对内毒素血症的治疗作用

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第四部分人锌指蛋白A20基因突变体构建及真核表达初步研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

本研究创新性评价

附图

文献综述：A20的泛素修饰抑制NF-κB活性

致谢

攻读博士期间发表论文及参加学术会议