纺锤体检查点蛋白BubR1和Cenp-E与肝癌细胞染色体数目异常的关系

摘要

目的： 研究纺锤体检查点(spindle checkpoint,SCP)蛋白BubR1和Cenp-E在癌组织和正常肝组织表达差异，利用间接免疫荧光技术与RNAi技术在肝癌细胞系(HepG-2)和正常肝细胞系(LO2)中进一步研究SCP基因BubRl和Cenp-E在肝癌细胞中的定位和作用。为进一步阐明肝癌细胞染色体数目异常的机理奠定基础。 方法： 1.用FQ-PCR和Western-blot，间接免疫荧光来检测SCP基因BubRl和Cenp-E在肝癌组织和正常肝组织基因和蛋白的表达情况。 2.用染色体分析技术分析人类肝癌细胞系(HepG-2)和人类正常肝细胞系(LO2)染色体数目异常情况。 3.用Nocodazole(诺考达唑)同时处理HepG-2细胞和LO2细胞使两种细胞高度同步在分裂期，流式细胞仪测定处理前后的HepG-2细胞和LO2细胞同步在分裂期情况。 4.利用FQ-PCR和Western-blot检测BubR1和Cenp-E基因在两种同步化的细胞mRNA和蛋白的表达水平。 5.间接免疫荧光技术观察Cenp-E蛋白在两种细胞中的定位及表达。 6.在LO2细胞中用RNAi技术干扰Cenp-E基因后，用FQ-PCR和Western-blot检测BubR1和Cenp-E基因在干扰前后mRNA和蛋白的表达水平。并利用MTT，间接免疫荧光进一步评价干扰后的细胞功能情况。 结果： 1.FQ-PCR和Western-blot，间接免疫荧光检测BubR1、Cenp-E基因在肝癌组织和正常肝组织表达，发现BubR1和Cenp-E在正常肝组织的表达明显高于肝癌组织，差异有统计学意义。 2.染色体分析发现HepG-2细胞染色体数目异常程度明显高于LO2细胞，差异具有统计学意义。 3.用流式细胞仪检测用Nocodazole处理前后的HepG-2细胞和LO2细胞发现处理前两种细胞G2-M期的比例差异不显著。处理后两种细胞的G2-M期细胞都大幅增加，但两组细胞中期细胞比例差异不显著。 4.FQ-PCR和Western-blot结果显示，Nocodazole处理前BubR1和C-E基因和蛋白在LO2和HepG-2细胞中表达无显著差异，处理后BubR1和Cenp-E基因和蛋白在两种细胞表达都增高，但LO2细胞上调水平大于HepG-2细胞，差异具有统计学意义。 5.间接免疫荧光结果显示Cenp-E蛋白主要定位细胞核内，并且在出现异常分裂的细胞核内Cenp-E蛋白的表达明显低于正常分裂的细胞核。 6.在干扰Cenp-E后，MTT显示LO2细胞的生长明显减慢。间接免疫荧光显示干扰后的LO2细胞中出现核异常比例明显高于正常细胞。 结论： BubR1和Cenp-E在正常肝组织的表达明显高于肝癌组织。BubR1和Cenp-E但LO2细胞应激上调水平大于HepG-2细胞，在LO2细胞干扰Cenp-E基因以后发现细胞增殖受到抑制。BubR1和Cenp-E过低表达可能是肝癌细胞染色体数目异常重要原因之一。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分 纺锤体检查点蛋白BubR1和Cenp-E在肝癌组织和正常肝组织中的表达

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二部分 Cenp-E蛋白在HepG-2细胞和LO2细胞中的应激表达

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第三部分 BbuR1蛋白在HepG-2细胞和LO2细胞分裂期的应激表达

1.材料与方法

2.结果

3.计论

第四部分 RNAi干扰抑制Cenp-E蛋白在LO2细胞中的表达

1.材料与方法

2.结果

3.计论

参考文献

全文总结

文献综述 纺锤体检查点(spindle checkpoint)的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的文章