CENP-E蛋白结构域在纺锤体检查点中的功能研究

摘要

细胞分裂时染色体平均分配到子代细胞中，这是保持亲代与子代遗传物质的稳定性的基础，纺锤体检查点是保证染色体正确分离的一个重要机制，如果纺锤体检查点功能异常就会导致非整倍体细胞形成，甚至与肿瘤发生相关，因此研究纺锤体检查点作用机制对进一步探明肿瘤发生的机制具有重要意义。 近年来纺锤体检查点机制的关闭/灭活得到越来越多的关注，因为纺锤体检查点机制提前关闭会引起染色体错误分离从而形成非整倍体细胞。CENP-E、Mps1蛋白与纺锤体检查点机制关闭/灭活关系密切。本课题运用分子克隆方法从Hela细胞中扩增CENP-E的cDNA，构建含CENP-E蛋白结构域的六个真核表达载体；利用流式细胞术等方法分析CENP-E蛋白结构域对纺锤体检查点功能的影响，以此分析CENP-E蛋白与微管连接状态与纺锤体检查点关闭/灭活的关系；同时利用原核表达载体将CENP-E具有磷酸化位点的截短体，Mps1全长蛋白进行表达纯化；运行荧光共振能量转移（FRET）方法和免疫共沉淀方法研究与Mps1蛋白有相互作用的CENP-E蛋白结构域，为进一步研究CENP-E蛋白和Mps1间作用与纺锤体检查点机制关闭/灭活的关系打下基础。 目的： 1.克隆CENP-E基因cDNA； 2.构建含CENP-E蛋白结构域的真核表达载体。 3.构建含CENP-E蛋白磷酸化位点的截短体及Mps1全长蛋白的原核表达载体并纯化蛋白。 方法： 1.用RT-PCR的方法从Hela细胞总RNA中获得编码CENP-E蛋白的CENP-E cDNA序列。 2.将CENP-E蛋白结构域cDNA插入pEGFP-C1真核表达载体； 3.将测序鉴定正确的重组质粒转染HEK293细胞，在倒置荧光显微镜下观察重组质粒表达情况。 4.收集转染重组质粒的HEK293细胞提取总蛋白，western blot鉴定重组蛋白（抗GFP小鼠单克隆抗体）。 5.原核表达载体构建及用亲和层析纯化重组蛋白 结果： 1.RT-PCR扩增的CENP-E cDNA与T J.Yen提交Genebank（ACCESSION：NM_001813）序列比较，RT-PCR产物缺失CENP-E基因第38个外显子。与CENP-E突变体比对同源性达99％，结果表明RT-PCR得到了正确的产物。 2.真核重组质粒转染HEK293细胞后在细胞内定位与预期结果相似。 3.重组质粒表达的蛋白与预期分子量相同。 4.原核表达出正确分子量大小的蛋白且得到较纯的蛋白。 结论： 1.得到正确的CENP-E基因cDNA但与最先提交的序列有差异。 2.成功的构建了含CENP-E蛋白结构域的真核表达载体。 3.成功构建含CENP-E磷酸化位点的及Mps1全长蛋白的原核表达载体并纯化成功。 目的： 1.分析Hela细胞中CENP-E基因mRNA表达情况。 2.分析几种肿瘤细胞株（Hela、T24、A549、U251、HepG2）和两种肿瘤（肝细胞癌和肾癌）及癌旁组织中的CENP-E mRNA表达情况。 3.研究基因组DNA是否存在CENP-E第38个外显子缺失。 方法： 1.采用RT-PCR方法，以Hela细胞总RNA为模板，分析Hela细胞中CENP-E mRNA表达情况； 2.采用PCR方法扩增几种不同肿瘤组织、癌旁组织和肿瘤细胞株基因组DNA，分析在基因组DNA是否存在第38个外显子缺失。 3.采用RT-PCR方法同时扩增缺失型和野生型CENP-E mRNA，分析缺失型和野生型CENP-E mRNA的表达量。 结果： 1.Hela细胞中同时存在缺失型和野生型CENP-E mRNA。 2.肝癌、肾癌及相对应的癌旁组织和几种肿瘤细胞株的基因组DNA没有发现CENP-E缺失突变现象。 3.肝癌与肾癌组织及几种肿瘤细胞株中突变型CENP-E表达量较野生型高，癌旁组织中野生型CENP-E表达量较突变体高。 结论：CENP-E基因mRNA在同一细胞内存在二种或两种以上的剪切体，CENP-E突变体可能与肿瘤有关。 目的： 1.分析CENP-E蛋白结构域与纺锤体检查点机制关闭的关系。 2.CENP-E蛋白在纺锤体检查点中发挥功能是否依赖于着丝点。 方法： 1.HEK293细胞转至六孔板培养，分别转入含CENP-E蛋白结构域的重组质粒和pEGFP-C1空载质粒。 2.采用胸腺嘧啶核苷对HEK293细胞进行双处理，大部分细胞同步于G1/S期。去除胸腺嘧啶核苷后，用新鲜培养基继续培养7h加诺考达唑处理2h。 3.收集第7h组和第9h组细胞经流式细胞术进行细胞周期分析，分析第7h和第9h各组细胞的G2/M期细胞比例变化情况，同时进行细胞分裂指数测定和细胞死亡率测定。 4.收集第9h的各组细胞进行染色体染色体计数分析，了解CENP-E蛋白结构域对染色体分离的影响。 结果： 1.HEK293细胞经双胸腺嘧啶核苷处理后，去除药物释放7小时大部分细胞进入G2/M期。 2.流式细胞术结果表明转染含CENP-E蛋白动力结构域（pEGFP-E1组和pEGFP-ET1）组第9h G2/M期细胞比例低于第7h，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05），而其它组细胞第9h G2/M期细胞比例高于第7h，与对照组比较无统计学意义（P>0.05）。细胞分裂指数测定也符合流式细胞术结果。 3.细胞死亡率测定发现转染pEGFP-E1组和pEGFP-ET1组第9h细胞死亡率高于第7h，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05），其它转染CENP-E结构域重组质粒组细胞死亡率与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。 4.转染pEGFP-E1组和pEGFP-ET1组细胞经染色体计数分析，经诺考达唑同步处理后非整倍体细胞数目增多，与对照组比较有统计学意义（P<0.05）；其它转染CENP-E结构域重组质粒非整倍体细胞数目与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论：CENP-E蛋白动力结构域与纺锤体检查点机制关闭有关；过度只含CENP-E蛋白动力结构域的蛋白能使纺锤体检查点机制提前关闭。 目的： 探索与Mps1有相互作用的CENP-E蛋白结构域 方法： 1.用荧光共振能量转移方法研究CENP-E结构域与Mps1蛋白间的相互作用。 2.免疫共沉淀实验对荧光共振能量转移实验结果进行验证。 结果： 1.荧光共振能量转移实验结果表明CENP-E3结构域与Mps1蛋白间有相互作用。 2.免疫共沉淀结果与荧光共振能量转移实验结果一致。 结论：与Mps1蛋白有相互作用的CENP-E蛋白结构域位于1200-2134位氨基酸；荧光共振能量转移对蛋白质相互作用的实验结果可信度较高。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分 人CENP-E cDNA结构域分子克隆

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 初步探讨CENP-E基因在癌组织及癌细株中的变异情况

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分 CENP-E结构域与纺锤体检查点机制关闭的关系

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第四部分 与Mps1有相互作用的CENP-E蛋白结构域分析

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述一 FRET技术在蛋白质相互作用研究中的应用

文献综述二 纺锤体checkpoint机制对细胞周期的调控

致谢

攻读学位期间发表论文