从巨噬细胞Ipr1基因功能研究探讨结核分枝杆菌感染固有免疫的调节机制

摘要

2005年，哈佛大学的Pan等在小鼠巨噬细胞内发现了一个介导巨噬细胞抗胞内病原体的基因--胞内病原体抗性基因1（intracellular pathogen resistance1，Ipr1），该基因与结核病的易感性有着密切的联系。表达Ipr1基因的小鼠，感染Mtb后巨噬细胞发生凋亡，细菌不易增殖。而Ipr1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬细胞表现为坏死，从而利于细菌在宿主体内的增殖与扩散。然而，Ipr1基因增强巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的机制还不清楚。 本课题通过RT-PCR法从C57BL/6J小鼠胸腺组织中获取Ipr1基因，构建真核表达质粒pEGFP-Ipr1，观察Ipr1基因在细胞水平调节巨噬细胞抗分枝杆菌的作用。构建Ipr1和绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）真核共表达穿梭质粒pBGOI，然后将该穿梭质粒电转到卡介苗BCG中，构建可靶向递送pBGOI质粒进入巨噬细胞中进行表达的重组卡介苗BCGi，并在细胞水平和小鼠体内观察该重组卡介苗的表达。通过重组卡介苗BCGi靶向递送Ipr1基因于感染Mtb的小鼠体内，观察重组卡介苗BCGi对小鼠Mtb感染的作用，运用基因芯片技术、蛋白芯片技术、Real-time PCR、ELISA检测实验组和对照组与免疫相关分子的表达差异，初步探讨Ipr1基因在抗Mtb感染中的可能的作用机制。 第一部分Ipr1基因表达对巨噬细胞抗分枝杆菌感染的影响。 目的：获取Ipr1基因全长编码序列，构建Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体，鉴定Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达及细胞内定位，观察Ipr1基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞体外杀伤结核分枝杆菌H37Ra作用的影响。 方法：从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA，以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列，克隆至真核表达载体pEGFP-C1，获得真核表达质粒pEGFP-Ipr1，经PCR、酶切鉴定正确后，脂质体转染pEGFP-Ipr1至小鼠巨噬细胞株RAW264.7，采用RT-PCR法，Western blotting法分别在转录水平及翻译水平检测Ipr1基因的表达及激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。应用G418压力筛选稳定表达Ipr1基因的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，获得高表达Ipr1基因的巨噬细胞。体外感染分枝杆菌H37Ra，感染后24h及96h细胞裂解物细菌培养菌落计数（CFU）的方法观察巨噬细胞抗结核分枝杆菌H37Ra感染活性。 结果：从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-Ipr1，转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，经RT-PCR、Western blotting鉴定Ipr1基因在转录水平及翻译水平获得表达，共聚焦显微镜观察Ipr1融合绿色荧光蛋白表达产物定位于细胞核内。经G418压力筛选后获得稳定表达Ipr1基因的RAW264.7细胞。细胞水平抗分枝杆菌H37Ra实验结果显示Ipr1基因表达的实验组巨噬细胞裂解物细菌培养菌落计数（CFU）低于对照组细胞，差异具有统计学意义（p<0.05）。 结论：成功获取小鼠Ipr1基因全长编码序列，构建了Ipr1基因与EGFP基因融合表达质粒pEGFP-Ipr1，Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。G418压力筛选出高表达Ipr1基因的细胞。体外抗菌实验表明Ipr1基因的表达增强了巨噬细胞杀伤胞内吞噬的结核分枝杆菌H37Ra的能力。 第二部分靶向递送pBGOI真核质粒的重组BCGi的构建及鉴定。 目的：构建Ipr1和绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）真核共表达穿梭质粒pBGOI，并在人肺腺癌细胞株A549中进行表达。构建可靶向递送pBGOI质粒进入巨噬细胞中进行表达的重组卡介苗BCGi，并在细胞水平和小鼠体内观察该重组卡介苗的表达。 方法：将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入双启动子真核共表达载体pBudCE4.1质粒中，构建pBOGI穿梭质粒，脂质体法转染pBOGI质粒于培养的A549细胞中，RT-PCR法、免疫组化、Western Blotting、荧光显微镜检测Ipr1和GFP的表达.将pBGOI电转入卡介苗BCG中，构建重组卡介苗BCGi，PCR进行鉴定，扩增，将BCGi导入RAW264，7细胞后作RT-PCR、Western Blotting检测目的基因的表达。重组BCGi滴鼻方式免疫BALB/c小鼠，以RT-PCR法，免疫组化法检测肺脾组织中目的基因的表达。 结果：酶切和测序分析表明pBGOI真核共表达穿梭质粒构建成功.pBGOI转染A549细胞后，RT-PCR、Western Blotting法检测到目的基因的表达。荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达，免疫组化可以检测到Ipr1蛋白的表达。菌落PCR鉴定重组卡介苗BCGi构建成功，BCGi导入RAW264.7细胞，RT-PCR法检测到目的基因的表达。重组BCGi滴鼻免疫的方式免疫BALB/c小鼠，RT-PCR法，免疫组化法检测到肺脾组织中目的基因的表达。 结论：成功构建真核共表达穿梭质粒pBGOI，成功构建重组卡介苗BCGi，为进一步研究Ipr1的功能及作用机制奠定基础。 第三部分 Ipr1基因抗小鼠Mtb感染的作用及机制的初步探讨。 目的：重组卡介苗BCGi靶向递送Ipr1基因于感染结核分枝杆菌的小鼠体内，观察重组卡介苗BCGi对小鼠结核分枝杆菌感染的作用及可能的分子机制。 方法：用BCGi免疫感染了结核分枝杆菌Mtb的C3HeB/FeJ小鼠，3周后处死，检测肺脾器官荷菌量、肺脾病理学改变、以及Ipr1在肺组织的表达，并做小鼠肺组织基因芯片检测、小鼠肺组织Real-time PCR检测、小鼠血清细胞因子蛋白芯片检测、小鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ的检测。 结果：重组BCGi组肺脾器官荷菌显著降低。重组BCGi组小鼠肺组织病变范围和程度轻于PBS组和BCG组。免疫组化检测到小鼠肺组织中有Ipr1的表达。基因芯片结果中BCGi组比BCG组上调2倍的基因有：Igh-6、Lbp、Ltf、Ly96、Ncf4、Nfkb1、Nfkb2、Nfkbia、Nos2、Prg2、Sftpd、Stabl、Tlr4。Real-time PCR实验结果Fas、Mcl1、Bc12、Caspase3、iNOS、LRG47、NRAMP1基因上调。血清蛋白芯片结果，BCGi组比BCG组下调1.3倍的炎症细胞因子有Eotaxin、Eotaxin-2、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-10、IL-17、I-TAC、Leptin、TNFα。ELISA结果中重组BCGi组血清IFN-γ水平明显高于BCG组。 结论：重组BCGi对小鼠结核病有一定的免疫治疗作用。Ipr1基因通过增强固有免疫抗Mtb感染，特别是增强TLR4的活化途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分 Ipr1基因表达对巨噬细胞抗分枝杆菌感染的影响

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4小结

第二部分 靶向递送pBGOI真核共表达质粒的重组卡介苗BCGi的构建及鉴定

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4小结

第三部分 Ipr1基因抗小鼠结核分枝杆菌感染的作用及其机制的初步探讨

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4小结

全文小结

参考文献

文献综述 结核病疫苗现状与展望

致 谢

攻读博士学位期间发表的文章