Ipr1基因在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用与机制的实验研究

摘要

本课题从C57BL/6J小鼠的胸腺组织通过RT-PCR法获得Iprl(intracellular pathogen resistance 1，细胞内病原体抗性基因1)基因全长编码序列，克隆入真核表达载体，体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，并在转录水平及翻译水平鉴定了Iprl基因的表达，并确定了Iprl基因表达产物的细胞内定位。观察了Iprl基因的表达对巨噬细胞生长状态的影响及巨噬细胞体外抗分枝杆菌H37Ra感染活性的影响。运用基因芯片技术检测Iprl基因的表达与巨噬细胞抗Mtb感染的免疫应答机制中的相关因素之间相互关系，初步探讨了Iprl基因在巨噬细胞抗Mtb感染中的作用机制。 第一部分 Iprl基因的获取及原核表达载体的构建和表达 目的：获取Iprl基因全长编码序列，构建Iprl基因原核表达载体，转化大肠杆菌，诱导重组蛋白表达，制备抗Iprl多克隆抗体。 方法：从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA，以RT-PCR法调取Iprl基因编码序列，上下游引入BamHⅠ、PstⅠ酶切位点，克隆至pMD19-T simple载体中获得重组质粒pMD19-T simple-Iprl，转化大肠杆菌JM109，筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复，测序正确后获得含正确Iprl序列的重组质粒﹡pMD19-T simple-Iprl。将Iprl基因亚克隆于原核表达载体pQE30，获得原核表达质粒pQE30-Iprl；以重组质粒﹡pMD19-T simple-Iprl为模板，PCR法扩增Iprl基因，上下游分别引入Kpn I、BamH I酶切位点，构建另一原核表达质粒pET32a(+)-Iprl。将pQE30-Iprl转化表达菌株SG13009、M15；pET32a(+)-Iprl转化表达菌株BL21、BL21(pLyS)，IPTG诱导目的基因的表达，SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况。 结果：从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变，经点突变修复后与GenBank报道的Iprl基因序列一致。亚克隆获得重组原核表达质粒pQE30-Iprl经酶切鉴定正确，构建的另一原核表达质粒pET32a(+)-Iprl经测序鉴定正确。pQE30-Iprl、pET32a(+)-Iprl分别在其相应表达菌株IPTG诱导表达，均未成功表达出Iprl重组蛋白。 结论：成功获取小鼠Iprl基因全长编码序列并成功构建含Iprl基因的两种原核表达质粒pQE30-Iprl、pET32a(+)-Iprl，但Iprl基因原核表达获取重组蛋白未获成功，提示Iprl基因原核表达可能有一定难度。 第二部分 目的：构建小鼠Iprl基因与EGFP基因融合表达载体，鉴定Iprl基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达及细胞内定位。 方法：限制性内切酶KpnⅠ、BαmHⅠ双酶切重组原核表达质粒pET32a(+)-Iprl及真核表达载体pEGFP-C1，获得的Iprl基因片段与pEGFP-C1载体大片段连接后获得真核表达质粒pEGFP-Iprl，经PCR、酶切鉴定正确后，脂质体瞬时转染pEGFP-Iprl至小鼠巨噬细胞株RAW264.7，以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照。采用RT-PCR法、Western blotting法分别在转录水平及翻译水平检测Iprl基因的表达及用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。 结果：成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-Iprl，瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，经RT-PCR、Western-blotting鉴定Iprl基因在转录水平及翻译水平获得表达，Iprl基因编码产物分子量大约50kD左右，荧光显微镜及共聚焦显微镜观察Iprl融合绿色荧光蛋白表达产物定位于细胞核内。 结论：成功构建了Iprl基因与EGFP基因融合表达质粒pEGFP-Iprl，成功转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，在转录及翻译水平检测到Iprl基因表达，Iprl基因表达产物定位于细胞核内。 第三部分 Iprl基因表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7生长的影响及杀伤分枝杆菌作用的研究 目的：观察Iprl基因表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的生长状态的影响，以及Iprl基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞体外杀伤结核分枝杆菌H37Ra作用的影响。 方法：1.采用脂质体瞬时转染的方法将Iprl基因真核表达质粒pEGFP-Iprl转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，同时转染空质粒pEGFP-C1作为对照组，应用MTT法检测Iprl基因的表达对巨噬细胞的生长是否有抑制作用；应用TUNEL原位凋亡检测Iprl基因表达对巨噬细胞是否有致凋亡作用。2.应用G418压力筛选稳定表达Iprl基因的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，获得高表达Iprl基因的巨噬细胞(实验组细胞)，同时筛选空质粒pEGFP-C1转染稳定表达GFP的细胞(对照组细胞)。3.体外感染分枝杆菌H37Ra，感染后24h及96h细胞裂解物细菌培养菌落计数(CFU)的方法观察实验组细胞(Iprl+)、对照组细胞(Iprl-)抗结核分枝杆菌H37Ra感染活性。 结果：1.MTT法检测未发现Iprl基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7有抑制生长的作用；TUNEL原位凋亡检测结果末发现Iprl基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7有促凋亡的作用。2.经G418压力筛选后获得稳定表达Iprl基因的RAW264.细胞及空GFP表达的RAW264.细胞。3.细胞水平抗分枝杆菌H37Ra实验结果显示Iprl基因的表达的实验组巨噬细胞裂解物细菌培养菌落计数(CFU)低于对照组细胞，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 结论：Iprl基因的表达产物对巨噬细胞的增殖无抑制作用，也不引起巨噬细胞凋亡。G418压力筛选出高表达Iprl基因的细胞。体外抗菌实验表明Iprl基因的表达增强了巨噬细胞杀伤胞内吞噬的结核分枝杆菌H37Ra的能力。 第四部分基因芯片初步探讨Iprl基因的表达对巨噬细胞结核抗分枝杆菌感染免疫应答的影响 目的：应用小鼠固有免疫及适应性免疫应答功能分类cDNA芯片检测Iprl基因在巨噬细胞的表达对感染结核分枝杆菌H37Ra的巨噬细胞抗感染免疫应答相关机制的影响及相互关系。 方法：实验组(Iprl+)巨噬细胞RAW264.7与对照组(Iprl-)巨噬细胞RAW264.7分别感染结核分枝杆菌H37Ra，于感染96h后分别提取两组的总RNA，逆转录合成cDNA及线性生物素标记的cRNA，纯化cRNA后与小鼠固有免疫及适应性免疫应答功能分类基因芯片(113个基因位点)杂交，应用化学发光检测基因芯片杂交结果，采集图像经软件分析得到基因表达差异的结果。应用实时定量PCR法对芯片结果中上调的3个基因检测以验证芯片结果的可靠性。 结果：基因芯片结果经数据分析发现Iprl基因的表达上调了11个巨噬细胞抗Mtb固有免疫机制中的有关分子的基因转录，其中与巨噬细胞抗Mbt感染关系密切的基因有：参与TLRs信号通路的分子：TLR2、TLR4、Irak1、Traf6，以及干扰素相关基因：Ifngr1(IFN-γR1)和肿瘤坏死因子相关基因：Tnfrsfla(TNFR1)。而巨噬细胞参与调节适应性免疫应答相关的分子的基因表达如：IL-1、TNF-α、IL-12等表达无明显差异。对于3个表达下调的基因Clecsf12、Illrap、Ltf由于其标准值较低(＜0.05)，其准确度较低，可能意义不大。经定量PCR反应对TLR2、TLR4及Ifngr1的检测结果与芯片结果分析表明定量PCR结果与芯片结果趋势一致。 结论：通过对基因芯片结果的分析，我们初步推测，Iprl基因的表达可能主要是增强巨噬细胞抗Mtb感染固有免疫机制的有关基因的表达，特别是TLR2/TLR4及与其信号转导有关的分子以及IFN-γR1、TNFR1的表达，促进巨噬细胞的活化及杀伤胞内吞噬的Mtb，发挥抗菌作用。为下一步研究Iprl基因作用的分子机制及作用位点提供了重要的参考依据。

目录

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分 Ipr1基因的获取及原核表达载体的构建和表达

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4小结

第二部分 Ipr1基因真核表达载体构建及细胞内表达鉴定和定位

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

第三部分Ipr1基因表达对巨噬细胞生长状态及吞噬杀伤分枝杆菌作用的影响

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4小结

第四部分 基因芯片初步探讨Ipr1基因的表达对巨噬细胞抗分枝杆菌感染免疫应答的影响

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

全文小结

参考文献

课题的创新性评价

文献综述 巨噬细胞抗Mtb因有免疫机制及遗传因素与结核病易感性的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的文章