人参有效成分对白血病KG1α细胞增殖抑制作用及其机制的探讨

摘要

采用化学药物治疗恶性肿瘤是临床治疗学中发展最快的领域之一,迄今研制的化学抗肿瘤药物多是细胞毒性强的药物,它们不能克服毒副作用大和选择性差的障碍。一方面许多肿瘤细胞还存在不同程度的对抗肿瘤化学药物不敏感,低剂量难以抑制肿瘤细胞的恶性增殖,高剂量又会导致机体组织器官的严重损伤,另一方面机体的造血与免疫系统等又对化疗药物极为敏感,即使较低剂量也可导致这些系统不可逆转的破坏。中医药现代化的核心内容之一是为中医药的理论体系提供现代科学的理论基础和实验依据。值得注意的是中医药在治疗肿瘤中已积累丰富的资料,中药的良好效果日渐受到人们的认可。若对初步筛选的抗肿瘤中药再通过现代生物医学技术对其进行结构分析、模似修饰、药理与毒理深入研究,完全有可能开发出全新、高效、低毒的抗肿瘤药物。
　　 目的：研究人参总皂甙(TSPG)和人参皂甙单体Rh2(S)对人急性髓系白血病细胞株KG1α增殖抑制的作用以及对细胞周期和凋亡的影响,并用免疫细胞化学和分子生物学的方法验证TSPG干扰KG1α生长的可能机制。
　　 方法：取对数生长期的KG1α细胞,调整密度为5×108/L,空白对照组予以常规培养;人参总皂甙TSPG组分别加入0.1,0.2,0.4,0.6,0.8g/L TSPG。采用MTT比色法测定细胞存活率,瑞氏染色法以及光镜、电镜观察细胞形态学改变。流式细胞仪测定细胞周期分布的变化以及细胞的凋亡率。免疫细胞化学的方法检测细胞中β-catenin和NF-κBp65蛋白表达的变化。RT-PCR半定量检测细胞中β-catenin、NF-κBp65、CyclinD1和TCF4的mRNA水平的变化。Western blot半定量检测细胞中β-catenin、NF-κBp65、CyclinD1和TCF4蛋白水平的变化。取对数生长期的KG1α细胞,调整密度为5×108/L,空白对照组予以常规培养;人参皂甙单体Rh2(s)组分别加入0.03,0.035,0.04,0.045,0.05 g/L Rh2(s)。采用MTT比色法测定细胞存活率,瑞氏染色法以及光电镜观察细胞形态学改变。流式细胞仪测定细胞周期分布的变化以及细胞的凋亡率。
　　 结果：人参总皂甙TSPG在体外对KG1α增殖具有明显抑制作用。在0.1-0.8g/L TSPG浓度范围内,其抑制作用呈浓度依赖性,在浓度0.4g/L处达到细胞的半数抑制率,且在48h抑制率达到高峰。与空白对照组比较,经0.4g/L TSPG作用48h后,可见细胞由成团聚集生长变为分散生长,细胞数量明显减少;细胞明显分化,产生核分裂像;部分细胞凋亡,.胞质中产生大量空泡并出现凋亡小体;KG1α细胞周期分布无明显变化;细胞凋亡率显著增高;免疫细胞化学显示细胞内β-catenin和NF-κBp65蛋白表达降低,其表达区域由胞核向胞膜转移;RT-PCR半定量检测细胞中β-catenin、NF-κBp65、CyclinD1和TCF4的mRNA的水平降低。Western blot半定量检测细胞中β-catenin、NF-κBp65和TCF4的蛋白水平下降。人参皂甙单体Rh2(s)在体外对KG1α增殖具有明显抑制作用。在0.03-0.05g/L Rh2(s)浓度范围内,其抑制作用呈浓度依赖性,在浓度0.04g/L处达到细胞的半数抑制率,且在48h抑制率达到高峰。与空白对照组比较,经0.04g/L Rh2(s)作用48h后,也可见细胞呈分散生长,数量明显减少;部分细胞分化产生核分裂像,还有部分细胞凋亡,胞质中出现空泡以及凋亡小体;空白对照组与体外培养48h后0.04g/LRh2(S)组G0/G1期和G2+M期的细胞分布结果相比,差别有统计学意义。而两组的S期差别无统计学意义。此外,经Rh2(S)处理后细胞凋亡率也明显增高。
　　 结论：人参总皂甙TSPG可抑制KG1α细胞增殖,诱导细胞凋亡,且TSPG抑制KG1α细胞增殖的作用机制可能与其降低β-catenin、NF-κBp65、CyclinD1和TCF4的mRNA的水平,抑制β-catenin、NF-κBp65和TCF4的蛋白表达有关。人参皂甙单体Rh2(S)可抑制KG1α细胞增殖,将KG1α阻滞于G0/G1期。FCM测细胞凋亡率的结果显示,Rh2(S)可诱导细胞凋亡。在TSPG的实验研究中,对照组凋亡率为(8.49±0.66)％,TSPG组凋亡率为(23.56±0.99)%;在Rb2(S)的实验研究中,对照组凋亡率为(2.58±0.40)%,RhZ(S)组的凋亡率为(10.44±3.17)%。TSPG引起细胞凋亡率改变的幅度与Rh2(S)引起细胞凋亡率改变的幅度没有统计学差异。由此可见,Rh2(S)诱胞凋亡的能力与TSPG相当,但其作用机制有可能与TSPG不同,这有待我们进一步研究探讨。