肋软骨膜、肋软骨和骨髓来源间充质干细胞的比较

摘要

由于间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)来源的多样性、体外诱导的多向分化性，没有特定的表面表记等特点，对其起源有不同的观点。学者们多认为MSCs是存在于组织和器官中的成体干细胞经体外培养扩增而成。但Orkin等提出：体内也可能不存在MSCs，只是在体外培养分离到的细胞时，这些细胞被激发转变或者基因重编，成为具有干细胞特性的细胞。成熟的细胞能否转化成干细胞呢?已有报道从软骨中分离到干细胞，但体内仅生长区外的软骨组织中无干细胞，关节软骨也有干细胞。从软骨中分离到的干细胞是来自软骨中的干细胞还是由软骨细胞转化而成的呢?本实验拟分别从兔非生长区肋软骨膜、肋软骨和骨髓中分离、培养、扩增获得干细胞，观察软骨细胞能否转化为干细胞?几种来源干细胞的差异?有助于认识成体干细胞体外分离获取的机制，以及干细胞临床应用研究的基础理论。
　　第一部分兔肋软骨膜、肋软骨和骨髓来源干细胞的分离培养
　　1材料与方法
　　取3-4周新西兰大白兔的肋软骨(避开肋生长板区)，解剖显微镜下剥离软骨膜，肋软骨和肋软骨膜均经酶消化法分别获取肋软骨和肋软骨膜细胞；另取股骨、胫骨的骨髓细胞。三种来源的细胞均以贴壁法分离、培养、扩增，分别获得3种来源的干细胞。观察3者各代细胞的形态和生长。
　　取三种来源的第3代细胞，以1×104个细胞接种于24孔培养板中培养，每天随机各取3个培养孔，共10天，计数细胞数，绘制生长曲线。
　　2结果
　　从肋软骨膜中分离的原代细胞接种12h后开始贴壁，5-6 d细胞融合，聚集成团，以圆形和多边形为主，从第2代开始细胞形态均一，以梭形为主，呈漩涡状排列。目前己传至15代。从肋软骨中分离的原代细胞6h后开始贴壁，5-6天细胞融合，以铺路石形态为主，第2代和第3代细胞逐渐转变成梭形；但第5代出现细胞老化，只传至第6代。原代骨髓细胞培养4-5h后开始贴壁，10d左右细胞融合。融合时细胞可见梭形，第2代以后细胞形态以梭形为主，呈明显漩涡状排列，已传10代，生长良好。
　　三种来源细胞第3代细胞的生长曲线表明：贴壁后生长潜伏适应期为1-3 d；3 d后即进入对数生长期；6 d后进入生长平台期。
　　第二部分肋软骨膜、肋软骨和骨髓来源干细胞的比较
　　1材料与方法
　　1.1三种来源的每一代细胞均以免疫组化染色方法检测每一代细胞CD29、CD90、CD34和Ⅱ型胶原的表达。
　　1.2取三种来源的第3代干细胞分别进行体外成脂诱导14天、成骨诱导21天；油红0和硝酸银染色法检测比较三种干细胞成脂、成骨的分化能力。
　　2结果
　　2.1免疫细胞化学染色发观原代及第1代肋软骨膜和肋软骨细胞均不表达CD29、CD90、CD34，从第2代细胞开始表达CD29、CD90，仍不表达CD34。原代骨髓细胞可表达CD29、CD90和CD34，不表达Ⅱ型胶原；随后只表达CD29和CD90。三种来源的第3代细胞均只强表达CD29、CD90，其均一性都达到99％以上。作为软骨细胞标记物之一的Ⅱ型胶原，仅原代及第1代肋软骨细胞表达，从第2代细胞不再表达。
　　2.2三种来源的第3代干细胞经成脂诱导14天后，肋软骨膜和骨髓来源的干细胞形状多由梭形转变为圆形，肋软骨来源的干细胞则逐渐转变为长梭形，细胞内均可见油红O染色的红色小脂滴。成骨诱导21天后，肋软骨膜和肋软骨来源的干细胞呈复层生长，而骨髓来源的干细胞成单层生长。经过硝酸银染色后，黑色钙化小结节分散于肋软骨膜和肋软骨来源的干细胞表面；骨髓来源的干细胞表面的骨结节则聚集成团。
　　全文结论
　　1.用酶消化法，成功的分离、培养和扩增了兔肋软骨膜和肋软骨来源的干细胞。用贴壁法提取了骨髓细胞。体外多次传代后，肋软骨膜和骨髓来源的干细胞比肋软骨来源的干细胞具有更强的生长增殖能力。
　　2.免疫组化检测显示肋软骨膜和肋软骨细胞从第2代开始均表达MSCs的表型，至第三代强表达。表明这两种细胞第3代具有MSCs的表型特征。
　　3.肋软骨膜和肋软骨来源的第3代干细胞在体外经诱导后具有与BMSCs一致的成脂和成骨能力，证明这两种来源的细胞具有干细胞的多向分化特征。
　　4.原代肋软骨细胞表达软骨细胞的标记物Ⅱ型胶原，直至第2代细胞不再表达，但开始表达CD29和CD90。这表明：成熟的肋软骨细胞在体外培养也可去分化成为干细胞。
　　5.尽管肋软骨膜和肋软骨来源的干细胞均具有与BMSCs相同的免疫表型和成脂、成骨诱导分化能力，但肋软骨膜来源干细胞的生长明显优于肋软骨来源去分化后转化成的干细胞。因此，从软骨中分离获取干细胞时，应尽量保留软骨膜。