金黄色葡萄球菌外排蛋白QacA的优化表达研究

摘要

目的：不同菌种对密码子的偏好是影响重组蛋白表达的主要因素之一，本研究即是通过优化密码子的使用提高金黄色葡萄球菌主动外排基因qacA在大肠杆菌中的表达水平。
　　方法：以重组质粒pBluescriptⅡ SK(+)/qacA为模板，通过PCR方法扩增出带有AatⅡ和NheⅠ酶切位点的qacA基因，经酶切、纯化后用T4连接酶将其与同样酶切过的pET-cocol载体连接；同时根据大肠杆菌偏爱密码子，设计并合成密码子优化的qacA基因(oqacA)，将合成的基因插入到pET-cocol载体中。重组表达质粒pET-cocol/qacA及密码子优化的pET-cocol/oqacA转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表达情况，Western Blotting试验鉴定表达蛋白。最低抑菌浓度(MIC)测定携带pET-cocol/oqacA菌株对消毒剂的耐受性。
　　结果：(1).酶切鉴定证实qacA基因及oqacA基因已与原核表达载体pET-cocol连接，重组表达质粒pET-cocol/qacA及密码子优化的pET-cocol/oqacA已构建成功;(2).重组质粒pET-cocol/qacA转化大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后成功地表达了QacA蛋白，其分子量约为55千道尔顿；优化后重组质粒pET-cocol/oqacA在大肠杆菌中高效表达；(3).Western Blotting试验显示QacA表达蛋白与合成的特异性QacA一抗呈特异性免疫反应；(4)MIC测定表明携带pET-cocol/oqacA菌株对消毒剂的耐受性与携带pET-cocol/qacA菌株相比无明显变化，提示优化后qacA表达正确。
　　结论：优化后的pET-cocol/oqacA在大肠杆菌中得到高效表达，为深入研究其结构功能、设计有效外排抑制剂奠定基础。