金黄色葡萄球菌多药外排蛋白QacA的功能分析

摘要

目的:评价金黄色葡萄球菌多药耐药主动外排蛋白QacAα-螺旋1和2及TMS1上的氨基酸对于底物转运的重要性。
　　 方法:1.采用半胱氨酸定点诱变的方法诱变QacA蛋白α-螺旋1和2及TMS1上的氨基酸I2(异亮氨基酸)，S3（丝氨酸），F4(苯丙氨酸)，F5(苯丙氨酸)，T6(苏氨酸)，K7(赖氨酸)，D10(天冬氨酸)，M11(蛋氨酸)，R17(精氨酸)，W18(色氨酸)，T19(苏氨酸)，A20(丙氨酸)，V21(缬氨酸)，V22(缬氨酸)，V23(缬氨酸)，F29(苯丙氨酸)， D34(天冬氨酸)，P43(脯氨酸)，E48(谷氨酸)，E50(谷氨酸)，P51(脯氨酸)，将诱变质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取的诱变株质粒通过BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶筛选和基因测序验证。2.通过琼脂平板稀释法测定诱变株最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，并采用荧光运输试验检测诱变株运输活性。3.Western Blot验证各诱变株均表达QacA蛋白，并比较其表达量。
　　 结果:1.成功半胱氨酸定点诱变22个氨基酸，获得22株诱变菌株。2.MIC和MBC结果分析提示获得的诱变菌株S3C，T6C，R17C，T19C，A20C，F29C，E50C对所测药物完全恢复敏感性，F4C，F5C，P51C对所测药物耐药性明显降低，I2C，K7C，D10C，M11C，W18C，V21C，V22C, V23C, D34C, P43C, E48C和Q55C与QacA WT(pBluescriptⅡ SK(+)/qacA)菌株结果近似。运输试验结果与MIC、MBC结果一致，提示S3C, F4C, FSC, T6C, R17C, T19C, A20C, F29C, E50C, P51C诱变菌株失去对底物的转运能力。3.Western Blot提示S3C，F4C，F5C，T6C，R17C，T19C，A20C，F29C，E50C，P51C诱变菌株的QacA蛋白表达量与QacA WT菌株比较无明显差异。
　　 结论:QacA蛋白α-螺旋1和2及TMS1上的氨基酸S3，F4，F5，T6，R17，T19，A20，F29，E50，P51可能与QacA蛋白一价和二价阳离子底物的结合和转运功能密切相关。

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前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

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