不可逆性电穿孔消融宫颈癌细胞后残留细胞生物学行为的实验研究

摘要

宫颈癌为女性生殖系统最常见的三大恶性肿瘤之一。近年来其发病呈现出新特点：年轻化。目前宫颈癌的治疗方式主要包括手术、化疗及放疗，多数患者均能取得很好的治疗效果，但术后其生殖系统的结构和功能可受到一定的影响。然而年轻的患者保留生育功能的愿望强烈。因此，找到一种治疗方法，既可以有效的治疗肿瘤，又可保留患者的生育功能和性功能，成为近年来研究的热点。
　　脉冲电场为一种新兴的物理消融肿瘤的方法。研究发现细胞在不同脉宽及电场强度的脉冲作用下产生不同的生物学效应，从细胞的可逆性穿孔、不可逆性穿孔到细胞内处理效应。不可逆性电穿孔因其可击穿细胞膜，直接杀灭肿瘤细胞，被广泛用于肿瘤物理消融的研究。目前大量的研究均已证实了不可逆性电穿孔杀灭肿瘤的有效性。并总结出不可逆电穿孔消融肿瘤具有治疗时间短，疗效不依赖热效应，不受靶区血流的影响，可根据电极针的布阵和脉冲参数的选择使得治疗范围精确可控等优点。因此，不可逆电穿孔以其独特的优点在肿瘤治疗领域展现出广阔的应用前景。
　　肿瘤因其侵润性生长特性常与周围正常组织边界不清，因此在消融过程中脉冲电场作用区域的边缘难免会残留肿瘤细胞。而这些残存的肿瘤细胞的生物学行为的变化是影响疾病预后的关键。不可逆电穿孔消融后残留肿瘤细胞的生物学行为的研究目前甚少。因此，本课题以宫颈癌Hela、Siha细胞株为研究对象，采用亚致死剂量的脉冲电场消融肿瘤细胞。检测脉冲电场处理后残留肿瘤细胞生物学行为的变化，包括其增殖、迁移、侵袭、粘附能力及对顺铂敏感性的改变，并初步探讨其改变可能发生的分子机制。
　　第一部分不可逆性电穿孔消融宫颈癌细胞后残留细胞恶性生物学行为的研究
　　第一节亚致死剂量脉冲电场参数的筛选
　　目的：筛选不可逆性电穿孔体外消融宫颈癌细胞的亚致死剂量脉冲电场参数。
　　方法：根据前期实验结果设定参数并分为三个不同脉冲作用个数的实验组（8个、16个、24个），固定参数为：电压400V，脉宽100us，频率1Hz。试验中电击小室两电极之间距离为4mm，根据公式场强=电压/距离，本实验中场强为1000V/cm。将制备好的Hela、Siha细胞悬液加入电击小室中，分别施加上述三个不同参数的脉冲电场处理，对照组细胞悬液不予以脉冲电场处理。脉冲电场处理后立即采用cck-8法检测各组细胞活性，计算存活率，选取接近半数抑制Hela、Siha细胞活性的脉冲电场参数。
　　结果：脉冲电场处理后，cck-8法检测细胞活性可观察到Hela细胞8、16个和24个脉冲组细胞存活率分别为（78.73±7.21）％，（62.95±10.01）%，（39.45±3.11）%，Siha细胞为（76.23±6.91）%，（61.58±8.28）%，（37.65±2.98）%，Hela、Siha细胞3个组之间细胞存活率比较均有统计学差异（P<0.05）。其中以16个脉冲个数组的细胞存活率最接近50%。
　　结论：我们选择不可逆性电穿孔消融宫颈癌细胞的亚致死剂量参数为：场强1000V/cm，脉宽100us，频率1Hz，脉冲个数16个。
　　第二节亚致死剂量不可逆性电穿孔对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响
　　目的：观察亚致死剂量不可逆性电穿孔对人宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响
　　方法：体外培养宫颈癌Hela、Siha细胞株，分为脉冲组和对照组。脉冲组给予固定参数的脉冲电场处理（场强1000V/cm，脉宽100μs，频率1Hz，脉冲个数16个），对照组不予脉冲处理。采用cck-8法检测细胞活性，计算生存率，描记生长曲线。PI染色流式细胞术检测细胞周期。CFSE荧光标记流式细胞术检测细胞分裂增殖情况。同时采用划痕实验及transwell小室实验检测细胞迁移能力。Transwell侵袭试验及基质胶粘附实验分别检测细胞侵袭和黏附能力。
　　结果：脉冲电场处理后24h，cck-8检测细胞活性示 Hela、Siha细胞生长呈下降趋势，生长受到抑制。PI染色检测细胞周期显示脉冲电场处理后24h，Hela和Siha细胞处于G1期细胞明显增加（P<0.05），S期细胞明显下降（P<0.05）,细胞周期阻滞在G1期。CFSE荧光标记检测细胞增殖结果表明，脉冲处理后，Hela和Siha细胞分裂增殖能力明显受到抑制，处于分裂增殖后的第5-6代细胞较对照组明显减少（P<0.05）。划痕实验、transwell小室迁移、transwell小室侵袭实验和基质胶粘附试验结果显示，脉冲处理后，细胞的迁移能力，侵袭能力和粘附能力均未受到明显的影响，各实验组与对照组结果经分析无统计学差异（P>0.05）。
　　结论：亚致死剂量不可逆性电穿孔消融宫颈癌细胞Hela、Siha后，细胞的增殖能力受到明显的抑制。而细胞的迁移、侵袭和粘附能力未受到明显的影响。
　　第三节亚致死剂量不可逆性电穿孔影响宫颈癌细胞增殖能力的分子机制
　　目的：初步探讨亚致死剂量不可逆性电穿孔消融宫颈癌Hela、Siha细胞后影响细胞增殖能力的分子机制。
　　方法：实验分组同前。脉冲处理后24h，收集各组细胞提取蛋白，采用Western Blot法检测各组细胞增殖相关基因P53、P21、CDK2、PCNA的表达水平。
　　结果：脉冲电场处理后，Hela和Siha脉冲组细胞P53、P21的表达水平高于对照组，PCNA、CDK2表达较对照组减少（P<0.05）。
　　结论：不可逆性电穿孔对宫颈癌细胞增殖能力的影响可能通过促进P53-P21-CDK2信号通路的表达及下调PCNA的表达。
　　第二部分不可逆性电穿孔消融宫颈癌细胞后残留细胞对顺铂敏感性的研究
　　目的：研究亚致死剂量不可逆性电穿孔消融宫颈癌细胞对细胞顺铂敏感性的影响，并初步探讨其影响机制。
　　方法：体外培养宫颈癌Hela、Siha细胞株，分为脉冲组和处理组，脉冲组细胞给予亚致死剂量的脉冲电场治疗（场强1000V/cm，脉宽100us，频率1Hz，脉冲个数16个）。对照组不予电场治疗。对照组、脉冲组细胞均予以相同浓度的顺铂（5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、无顺铂）处理24h。采用cck-8检测细胞活性，计算顺铂抑制率，对比分析脉冲组和对照组顺铂抑制率差异。收集脉冲治疗组和对照组经顺铂溶液处理后的细胞，裂解收集细胞內液，采用高效液相色谱法（HPLC）检测各组细胞内液顺铂的浓度。收集细胞蛋白用于WesternBlot法检测铜离子转运蛋白（CTR1）的表达水平。
　　结果：cck-8检测细胞活性结果显示脉冲处理后，不同浓度的顺铂对细胞的抑制率均明显上升（P<0.05）。细胞内顺铂浓度检测结果显示，两种细胞脉冲处理组细胞内顺铂浓度均高于对照组（P<0.05）。Western Blot检测细胞铜离子转运蛋白（CTR1）的表达水平提示脉冲组铜离子转运蛋白（CTR1）的表达水平较对照组升高（P<0.05）。
　　结论：亚致死剂量不可逆性电穿孔可增加宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，其可能的机制为通过增加铜离子转运蛋白（CTR1）的表达，使得顺铂进入细胞的量增加。

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前言

参考文献

第一部分 不可逆性电穿孔消融宫颈癌细胞后残留细胞恶性生物学行为的研究

第一节 亚致死剂量脉冲电场参数的筛选

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二节 亚致死剂量不可逆性电穿孔对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三节 亚致死剂量不可逆性电穿孔影响宫颈癌细胞增殖能力的分子机制

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 不可逆电穿孔消融宫颈癌细胞后残留细胞顺铂敏感性的研究

1材料与方法

1.1材料

1.2脉冲处理

1.3 cck-8法检测不可逆电穿孔处理前后宫颈癌细胞对顺铂的敏感性

1.4 高效液相色谱法检测细胞内顺铂浓度

1.5 Western Blot检测铜离子转运蛋白（CTR1）的表达水平

2 结果

2.1 不可逆电穿孔对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响

2.2高效液相色谱法检测细胞内药物浓度

2.3不可逆电穿孔对宫颈癌细胞顺铂转运相关基因表达的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

附图

文献综述: 不可逆性电穿孔在肿瘤治疗领域的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的论文及科研工作