程序性坏死在慢性肾脏病进展中的作用及其可能机制的研究

摘要

第一部分：肾大部切除大鼠残肾细胞发生程序性坏死
　　目的：
　　程序性坏死是一种由细胞信号通路精确调控的细胞死亡方式，它在许多疾病中发挥了关键的病理、生理作用。但是，目前它在慢性肾脏病进展中的作用却未见报道。在本研究中，我们首先测定了肾大部切除大鼠模型术后不同时间点，残肾固有细胞发生程序性坏死的情况，以证明肾固有细胞发生的程序性坏死参与了肾大部切除大鼠的慢性肾损伤。
　　方法：
　　1.将健康雄性的SD大鼠随机分为SNX（肾大部切除术，32只）和control（32只）两组，分别行肾大部切除术或假手术造模。并将SNX组和co ntro l组实验大鼠分别按时间点随机分为4组：0w、4w、8w、12w组，每组8只。
　　2.测定肾大部切除大鼠肾功能和肾脏形态学改变，并利用电镜观察发生程序性坏死的残肾细胞。
　　3.应用qPCR、Western Blot及免疫组化法测定RIP1/3和LC3B重庆医科大学博士研究生学位论文
　　的表达情况。
　　结果：
　　1.从4w开始，肾大部切除大鼠尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、GSI和TIS明显增高(P＜0.05)，8w时这些指标进一步增高(P＜0.05)，但到12w时BU N、S c r、GS I和T IS的水平与8w时比较变化不明显(P＞0.05)。
　　2.电镜结果显示：肾大部切除术后8w,在残肾组织中可以发现具有典型坏死形态特征的程序性坏死细胞。但在肾大部切除术后0w，4w，12w均未发现残肾细胞发生明显的程序性坏死。
　　3. qPCR和Western Blot结果显示：RIP1、RIP3 mRNA、蛋白表达在肾大部切除术后4w开始增高；到术后8w进一步增高，较4w组表达增强（P＜0.01）；但到术后12w，增高的RIP1和RIP3 mRNA较8w明显降低（P＜0.01），虽然该时间点RIP1和RIP3蛋白与8w组相比无统计学差异，但表达量有所降低。免疫组化结果显示: RIP3主要于肾大部切除大鼠残肾的肾小管上皮细胞胞浆中表达，而在肾小球中仅见少量RIP3阳性表达。
　　结论：
　　1.在肾大部切除大鼠慢性肾损害过程中，残肾固有细胞发生了程序性坏死。
　　2.残肾固有细胞发生的程序性坏死高峰出现在肾大部切除术后8w。
　　第二部分：Necr os tat in-1对肾大部切除大鼠慢性肾损伤影响及其机制
　　目的：
　　应用RIP1特异性抑制剂necrostatin-1（Nec-1）或泛-caspase抑制剂Z-VAD干预肾大部切除大鼠来进一步探讨程序性坏死对肾大部切除大鼠慢性肾损伤的影响及大鼠残肾固有细胞发生程序性坏死的可能机制。
　　方法：
　　1.将SD大鼠随机分为SNX（18只）和control（6只）两组，分别行肾大部切除术或假手术。并将 S NX组大鼠再分为3组：SNX+vehic le组，SNX+Z-VAD组，SNX+Nec-1组。对SNX+Z-VAD组和S NX+Nec-1组大鼠，从术后4w开始分别腹腔注射Z-VAD和Nec-1，共4w。
　　2.评估Nec-1或Z-VA D对肾大部切除大鼠肾功能及肾脏病理改变的影响。
　　3.通过T UNEL染色和电镜观察Nec-1或Z-VA D对肾固有细胞死亡的影响。
　　4.应用qPCR、Western Blot测定Nec-1或Z-VAD对RIP1/3、MLKL、PGAM5、Drp1的表达的影响，并通过激光共聚焦观察 RIP1和RIP3在肾组织的表达位点。
　　5.应用 DCF H-DA化学荧光法检测肾大部切除大鼠残肾细胞内ROS含量。
　　结果：
　　1.电镜下，在vec hile或Z-VAD干预的肾大部切除大鼠残肾组织中可以发现典型的程序性坏死细胞。但在 Nec-1干预的肾大部切除大鼠及c o ntro l组大鼠中均未发现肾细胞发生明显的程序性坏死。
　　2.应用Nec-1干预肾大部切除大鼠后， RIP1和RIP3 mRNA和蛋白水平的增高得以控制（P＜0.01）。而应用Z-VAD干预后，增高的RIP1和RIP3 mRNA和蛋白水平下降不明显（P＞0.05）。
　　激光共聚焦显微镜可观察到：RIP1和RIP3蛋白主要共表达于残肾肾小管上皮细胞胞浆，在肾小球固有细胞中仅有少量表达或不表达。
　　3.应用Nec-1或Z-VAD干预后，大鼠的肾功能、肾脏病理改变和TUNEL阳性细胞数较SNX+vehicle组大鼠均有所降低（P＜0.01）。
　　4. Nec-1干预的肾大部切除大鼠残肾PGAM5、Drp1 mRNA表达量较 SNX+vehic le组显著下降（P＜0.05），但 Z-VAD不能抑制增高的PGAM5、Drp1 mRNA表达（P＞0.05）。应用Nec-1干预的肾大部切除大鼠残肾MLKL、Drp1蛋白表达和ROS含量较S NX+veh ic le组显著下降（P＜0.05），但PGAM5蛋白表达下降不明显（P＞0.05）。并且发现Z-VAD对肾大部切除大鼠 MLKL、PGAM5蛋白的高表达均无明显抑制作用（P＞0.05），但可阻断Drp1蛋白的高表达（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.肾大部切除大鼠残肾固有细胞发生的程序性坏死可能是由RIP1和RIP3共同介导的。
　　2.残肾固有细胞发生的这种RIP1和RIP3介导的程序性坏死是下游信号分子MLKL、Drp1和ROS等促发的。
　　第三部分：Ang2对S NX大鼠残肾细胞程序性坏死的影响及机制
　　目的：
　　为了进一步探讨肾大部切除大鼠残肾细胞发生的这种程序性坏死是由哪些刺激因素诱发的，我们应用Ang2抑制剂缬沙坦干预肾大部切除大鼠来进一步探讨残肾固有细胞发生的程序性坏死可能是由 Ang2诱发的。
　　方法：
　　1.将SD大鼠随机分为SNX组（12只）和control（6只）两组，分别行肾大部切除术或假手术。并将SNX组实验大鼠再分为2组：SNX组，SNX+valsartan（缬沙坦）组。对SNX+ valsartan组大鼠，从术后4w开始给予缬沙坦，持续灌胃4w。
　　2.应用qPCR、Western Blot测定缬沙坦对Ang2、RIP1/3、MLKL、PGAM5、Drp1的表达的影响。
　　3.通过激光共聚焦观察Ang2的表达位点。
　　4.应用DCF H-DA化学荧光法检测缬沙坦对肾大部切除大鼠残肾细胞ROS含量的影响。
　　结果：
　　1.肾大部切除大鼠残肾Ang2 mR NA和蛋白水平较对照组明显增高（P＜0.01）。激光共聚焦显微镜显示：Ang2蛋白主要表达于残肾肾小球、肾小管细胞胞浆。
　　2.应用缬沙坦干预肾大部切除大鼠后，SNX组高水平的 RIP1、Drp1mRNA得到控制（P＜0.05）， RIP3 mRNA水平有所降低，但与SNX组没有统计学差异（P＞0.05）；RIP1、RIP3、MLKL、Drp1蛋白表达水平均得以降低（P＜0.05）；同时，缬沙坦治疗后，ROS的水平较SNX组显著下降（P＜0.05）。
　　结论：
　　肾大部切除大鼠残肾固有细胞发生的RIP1和RIP3介导的程序性坏死可能是由Ang2诱导的。
　　第四部分：程序性坏死、自噬、凋亡在大鼠残肾细胞死亡中的相互作用
　　目的：
　　程序性细胞死亡主要包括凋亡、自噬与程序性坏死三种形式，为了探讨CKD进展过程中,肾脏细胞死亡的方式，我们分别应用抑制剂Z-VAD或3-MA或Nec-1干预肾大部切除大鼠，观察残肾程序性细胞死亡的方式有哪些，以哪种死亡方式为主，它们之间的关系如何。
　　方法：
　　1.将SD大鼠随机分为SNX（24只）和control（6只）两组，分别行肾大部切除术或假手术。并将 SNX组实验大鼠再分为4组：SNX+vehic le组，SNX+Z-VAD组，SNX+Nec-1组和SNX+3-MA组。从术后4w开始，对S NX+Z-VAD组、S NX+Nec-1组和S NX+3-MA组大鼠分别腹腔注射Z-VAD、Nec-1和3-MA，连续4w；对S NX+veh ic le组和control组大鼠仅给予10％ DMSO-PBS液。
　　2.应用qPCR和Western Blot测定RIP3、caspase-3、LC3BmRNA及蛋白表达。
　　结果：
　　1.应用Z-VAD干预后，残肾caspase-3 mRNA水平明显下降（P＜0.01），LC3B、RIP3 mRNA水平变化不明显（P＞0.05）。应用Nec-1干预后，残肾 caspase-3 mRNA水平无明显下降（P＞0.05），增高的LC3B、RIP3 mRNA水平明显降低（P＜0.01）。应用3-MA干预后，肾大部切除大鼠残肾增高的LC3B、RIP3 mRNA水平明显下降（P＜0.01），增高的caspase-3 mRNA水平变化不明显（P＞0.05）。
　　2.应用 Z-VAD干预后，残肾 c asp as e-3蛋白水平明显下降（P＜0.05）； RIP3蛋白水平变化不明显（P＞0.05）；而LC3B蛋白的表达反而增高（P＜0.05）。应用Nec-1干预后，残肾RIP3和LC3B蛋白水平明显下降（P＜0.05）；而 caspase-3蛋白水平变化不明显（P＞0.05）。应用3-MA干预后，残肾LC3B、RIP3蛋白水平明显下降（P＜0.01）；而caspase-3蛋白水平无明显变化（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.凋亡、自噬和程序性坏死这三种程序性细胞死亡方式均参与了肾大部切除大鼠的慢性肾脏病理损害。且这三种程序性细胞死亡方式是共同存在的,彼此互相联系,互相影响。
　　2.自噬可以作为程序性坏死信号通路的一个下游分子事件促进程序性坏死的发生。

目录

封面

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分肾大部切除大鼠残肾细胞发生程序性坏死

1材料与方法

2 结果

3讨论

参考文献

第二部分Necro statin-1对肾大部切除大鼠慢性肾损伤的影响及其机制

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分Ang 2对SNX大鼠残肾细胞程序性坏死的影响及机制

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第四部分程序性坏死、自噬、凋亡在大鼠残肾细胞死亡中的相互作用

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

文献综述: 程序性坏死在肾脏疾病中的作用

致谢

攻读博士学位期间发表的论文