受体相互作用蛋白3及经典程序性坏死信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用研究

摘要

背景:细胞死亡涉及到生命的多个环节，正面作用有：胚胎的发育，机体细胞的“新陈代谢”，反面左右有：炎症、肿瘤等。既往认为细胞死亡中除细胞凋亡是基因预存的主动死亡模式，是由细胞产生各种信号分子伴随能量消耗最终导致细胞死亡之外，其他的细胞死亡都是被动的不可逆的细胞死亡。2005年Degterev等提出一种新的细胞死亡方式：细胞程序性坏死。细胞的这种死亡方式具有坏死样结构特点，细胞膜完整性破坏，周围组织炎症反应，同时该过程受细胞内一系列信号分子调控。脑缺血所致脑损伤是我国神经科致死、致残的主要病因之一。如果能通过深入探索程序性坏死信号通路的生物化学机制，更进一步研究程序性坏死信号通路在相关疾病中的参与程度与作用，不但利于对该信号通路的认知，且对神经内外科相关神经缺血再灌注损伤相关疾病的治疗药物、治疗靶向、治疗方法起到拓宽、确立的重要作用。
　　目的:本实验研究体外培养神经元细胞在缺血再灌注损伤后 RIP3的变化规律。本实验受临床上脑梗死后出现缺血半暗带启发，研究并探讨程序性坏死在半暗带区和梗死区的分布，进一步揭示程序性坏死在脑缺血再灌注损伤中的作用机制。
　　方法:原代神经元培养，神经元细胞荧光鉴定，RIP3荧光鉴定，传代细胞HT22细胞培养及冻存，细胞造缺氧模型，动物造缺氧再灌注模型，PCR技术，Western Blotting技术，MTT技术，鼠脑TTC染色
　　结果: RIP3表达在缺血再灌注在体和体外模型中都有显著变化。在本实验所设之间点中，在缺血再灌注损伤后12小时RIP3表达达到高峰。小鼠海马来源细胞系HT22与大鼠皮层神经元造模后PCR结果趋势一致。动物造模后梗死区及半暗带区Western Blotting趋势一致，与细胞 PCR趋势一致。在体实验中，梗死区较半暗带区，RIP3表达波动显著。缺氧时间1小时NEC-1实验组细胞存活率较对照组升高不明显，而缺氧时间为4小时NEC-1实验组细胞存活率较对照组显著升高。
　　结论:脑缺血再灌注模型中，缺血区和半暗带区由于损伤程度不同，程序性坏死参与度不同，梗死区程序性坏死更活跃。
　　创新与不足:本实验受临床上脑梗死后出现缺血半暗带启发，探讨程序性坏死在半暗带区和梗死区的分布，进一步揭示程序性坏死在脑缺血再灌注损伤中的作用机制。动物模型中干预后组织细胞的坏死变化是否能或只能归因于程序性坏死成为疑问，这使结果分析变得困难，一些实验结果不能用已知道理论解释。

目录

声明

1.试剂成分及批号

2.实验方法

2.1原代神经元培养：

2.2神经元细胞荧光鉴定

2.3RIP3荧光鉴定

2.4传代细胞HT22细胞培养及冻存

2.5神经元造缺氧模型

2.6动物缺氧再灌注模型（MCAO）

2.7PCR

2.8WESTERN BLOTTING技术

2.9MTT(四甲基偶氮唑蓝微量酶反应)实验

2.10鼠脑TTC染色：

2.11统计学分析

3.实验结果：

4.结论：

5.讨论

5.1经典程序性坏死

5.2受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIP3)

5.3Nec-1（程序性坏死特异性抑制剂）

致谢

参考文献

综述：程序性坏死通路研究新进展