miRNA30a对乳腺癌腋窝淋巴结微转移灶中癌细胞干性基因表达和侵袭能力的影响

摘要

目的：探讨肿瘤干细胞在乳腺癌腋窝肿大淋巴结中微转移的分子机制以及miRNA30a对其侵袭能力的影响，为应用microRNA干扰技术治疗乳腺癌提供新的技术方案。
　　方法：以激光共聚焦检测乳腺癌及腋窝淋巴结微转移灶中肿瘤干细胞标志物的表达。从腋窝淋巴结中体外分离、培养乳腺癌干细胞。合成 miRNA30a寡核苷酸片段，应用腺病毒将该片段转染原代乳腺癌细胞，荧光显微镜评估转染效率。建立动物模型检测肿瘤干细胞的侵袭能力。RT-PCR检测肿瘤组织中 CD44、CD24、OCT4和 TWIST1的表达情况。以 Transwell小室体外侵袭实验检测转染前后肿瘤细胞增殖和侵袭力的变化。免疫组化检测荷瘤鼠肿瘤组织中 Vimentin和N-Cadherin、CK-17/19（Cytokeratin17/19）和 E-Cadhrein表达。Western blot分别检测 OCT4、ALDH1、Vimentin和 N-Cadherin蛋白表达情况，
　　结果：收集的42例乳癌患者标本均有腋窝淋巴结肿大，其中经重医附二院病理科H.E染色确认转移的为31例，11例为增生肿大的淋巴结。通过免疫激光共聚焦扫描、RT-PCR检测，在三种标本中均发现肿瘤干细胞标志物（CD44+CD24-和ALDH1+）的阳性表达，转录调节基因（OCT4和 Twist1)和侵袭分子（Vimentin和 N-Cadherin）表达水平上调,但增生肿大淋巴结在三种组织中最低。从腋窝肿大淋巴结中成功分离、培养了原代乳腺癌细胞，构建了重组质粒miRNA30a腺病毒转染剂；原代乳癌细胞平均转染效率为62.5﹪，MDA-MB-231细胞的平均转染效率为78.2﹪。Western blot检测显示原代乳癌细胞的干性分子表达和侵袭能力均较 MDA-MB-231细胞株强。以miR30a干扰后原代乳癌细胞和MDA-MB-231细胞株的细胞干性标志物（ALDH1及OCT4）和侵袭分子（Vimentin和 N-Cadherin）蛋白分子表达均较空白对照组有不同程度的下降。Transwell小室体外侵袭实验显示空白对照组中原代乳癌细胞较 MDA-MB-231细胞侵袭力强，其侵袭指数分别为（81.2±3.1﹪，56.3±2.7﹪），两者有显著差异性（P＜0.05），而转染miR30a后这两种细胞体外侵袭力均明显减弱，其侵袭指数分别为（24±1.7﹪,25±1.2﹪），两者之间无显著差异性（P＞0.05）；而空白对照组的侵袭力均明显强于前两种实验组细胞，几者之间相比差异有显著性（P＜0.05）。最后，空白对照组中原代乳癌细胞和MDA-MB-231细胞接种的荷瘤鼠原发肿瘤组织中 Vimentin和N-Cadherin蛋白上调表达而转移瘤中 E-Cadherin和 Ck-17/19表达上调，前者强于后者。然而被RNA干预后的两组细胞侵袭分子均表达下降（21.1±1.4﹪,25.3±1.6﹪），两者之间无显著差异性（P＞0.05）,而且至6周时未见转移瘤出现。
　　结论：我们发现乳癌患者腋窝增生肿大的淋巴结中部分出现肿瘤干细胞标志物和侵袭分子阳性表达，提示可能存在肿瘤微转移；理论上，对于腋窝中增生肿大淋巴结还是应完全清扫为宜。此外，miR30a可以抑制乳癌干细胞样瘤细胞的增殖和侵袭能力；利用 miRNAs技术对肿瘤细胞基因进行抑制可以为乳腺癌的治疗提供新的研究平台。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分乳腺癌腋窝肿大淋巴结中肿瘤细胞干性基因表达的检测

1 材料和方法

2 实验结果

3. 讨论

第二部分MIR30a对乳腺癌腋窝肿大淋巴结癌细胞干性基因和侵袭力的影响

1 实验器材及方法

3. 实验结果

4. 讨论

第三部分miR30a腋窝中大淋巴结乳癌细胞荷瘤鼠体内侵袭力的研究

1．实验材料及方法

2. 实验结果

3 .讨论

全文小结

综述文献：乳腺癌干细胞在肿瘤腋窝淋巴结转移中的作用

参考文献

致谢

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