丙戊酸钠对APP/PS1/Nestin-GFP三转基因痴呆小鼠海马神经发生作用的初步研究

摘要

目的：研究不同年龄段阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）痴呆模型小鼠海马神经发生（hippocampal neurogenesis）的动态变化，并观察临床一线抗癫痫药丙戊酸钠（valproic acid sodium salt, VPA）对APP/PS1/Nestin-GFP三转基因 AD模型小鼠海马神经发生的影响，探讨相关作用机制。本课题研究结果将为揭示 AD的发病机制及临床上AD的治疗提供新的实验依据。
　　方法：本课题分两部分进行。第一部分：将APP/PS1双转基因杂合体种鼠与 Nestin-GFP纯合体种鼠杂交，子代经基因鉴定分为APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠（AD组），和Nestin-GFP小鼠（WT组）。分别选取7天、1月、3月、7月龄小鼠作为研究对象，雌雄不拘，每个年龄段8–10只。应用BrdU标记示踪、免疫荧光染色及高尔基染色等技术，检测小鼠海马神经发生的动态变化。
　　第二部分：选取3月龄和7月龄APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠各8–10只。各年龄段内随机平均分为VPA治疗组和生理盐水对照组。VPA采取腹腔注射4周，剂量为30mg/kg·d，对照组用等量生理盐水替代。药物治疗4周后，进行Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力；应用BrdU标记示踪、免疫荧光及激光共聚焦成像、高尔基染色及蛋白印迹（Western blot）等技术，检测VPA对小鼠海马神经发生及老年斑的影响，并探讨相关机制。
　　结果：1.第一部分形态学检测结果：与正常小鼠相比，AD小鼠脑内神经干细胞（Nestin-GFP）数量显著减少（P＜0.01）、神经干细胞增殖（BrdU）明显受抑（P＜0.05），新生神经元、星形胶质细胞（DCX、GFAP）数量减少（P＜0.05），成熟神经元数量无明显差异（P＞0.05），神经元树突棘密度降低（P＜0.05）。
　　2.第二部分 Morris水迷宫检测结果显示：在可视平台实验中，3月龄和7月龄小鼠的VPA治疗组和生理盐水对照组找到平台的平均潜伏期及搜索路程均无明显差异（P＞0.05）；在隐蔽平台实验中，与生理盐水对照组相比，3月龄VPA治疗组小鼠在第4、5天找到平台的潜伏期显著缩短（P＜0.001），搜索路程显著缩短（P＜0.01）；7月龄VPA治疗组小鼠在第4、5天找到平台的潜伏期显著缩短（P＜0.01），搜索路程显著缩短（P＜0.01）；在探索实验中，60s内3月龄VPA治疗组小鼠穿越平台的次数较生理盐水对照组显著增多（P＜0.01）；7月龄VPA治疗组小鼠穿越平台次数较生理盐水对照组显著增多（P＜0.05）。
　　3.第二部分形态学实验结果：与生理盐水对照组相比，VPA治疗组小鼠脑内神经干细胞（Nestin-GFP）数量增加（P＜0.05）、神经干细胞增殖（BrdU）能力增强（P＜0.05），新生神经元（DCX）数量增多（P＜0.01）、星形胶质细胞（GFAP）数量增加（P＜0.05），成熟神经元数量无明显差异（P＞0.05），神经元树突棘的密度增加（P＜0.05），老年斑（4G8）数目减少、面积缩小（P＜0.05）。
　　4.第二部分蛋白水平实验结果：与生理盐水对照组相比，3月龄和7月龄VPA治疗组GSK-3β总蛋白水平均无明显差异（P＞0.05），而3月龄pSer9-GSK-3β蛋白水平明显升高（P＜0.05），7月龄pSer9-GSK-3β蛋白水平显著升高（P＜0.001）。
　　结论：
　　1. AD小鼠海马神经发生水平随年龄增长呈下降趋势；
　　2. APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠较正常小鼠海马的神经发生水平显著降低；
　　3.VPA处理能改善APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠的空间学习记忆能力；
　　4. VPA处理能减少APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠脑内老年斑的形成；
　　5. VPA处理能改善APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠海马神经发生能力；
　　6. VPA可能通过抑制GSK-3β的活性来发挥其有效作用。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分不同年龄段APP/PS1/Nestin-GFP三转基因AD小鼠海马神经发生

1材料与方法

1.1实验动物

1.2主要实验仪器

1.3主要试剂与配制

1.4实验方法

1.5统计学处理

2结果

2.1实验小鼠的基因鉴定

2.2不同年龄段小鼠脑内神经干细胞的表达与增殖情况

2.3不同年龄段小鼠脑内神经干细胞的分化情况

2.4不同年龄段小鼠脑内神经元的成熟情况

2.5不同年龄段小鼠脑内神经元树突棘的改变

3讨论

3.1 AD成年海马神经发生概述

3.2 APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠模型评价

3.3 AD脑内神经发生的部位

3.4 AD脑内神经干细胞增殖能力减弱

3.5 AD脑内神经干细胞迁移分化能力减弱

3.6 AD脑内神经元成熟受阻

小结

参考文献

第二部分VPA改善APP/PS1/Nestin-GFP三转基因AD小鼠海马神经发生

1材料与方法

1.1实验动物

1.2主要实验仪器

1.3主要试剂与配制

1.4实验方法

1.5统计学处理

2结果

2.1各组小鼠药物处理期间体重变化情况

2.2 VPA治疗对AD小鼠学习记忆能力的影响

2.3 VPA治疗对AD小鼠脑内神经干细胞增殖的影响

2.4 VPA治疗对AD小鼠脑内神经干细胞分化的影响

2.5 VPA治疗对AD小鼠脑内神经元成熟的影响

2.6 VPA治疗对AD小鼠脑内老年斑的影响

2.7 VPA对AD小鼠脑内GSK-3β活性的影响

3讨论

3.1 AD药物治疗概述

3.2 VPA改善APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠空间学习记忆能力

3.3 VPA促进APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠海马神经发生

3.4 VPA减少APP/PS1/Nestin-GFP三转基因小鼠脑内老年斑的形成

3.5 VPA发挥治疗作用的可能机制

小结

参考文献

全文总结

附图

文献综述: 成年海马神经发生与阿尔茨海默病关系的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文