丁酸钠抑制缺氧致血管内皮细胞通透性增加及其机制研究

摘要

目的：
　　血管内皮通透性的增加是很多疾病的病理基础。缺氧是临床常见的病理过程，是多种疾病的重要致病因素。研究表明，缺氧可以改变内皮细胞之间的连接作用，破坏血管内皮的完整性，使细胞收缩，细胞间隙增大，细胞间连接复合物的结构破坏，从而使血管内皮细胞通透性增高，如何保护血管内皮的完整性，抑制缺氧导致的血管内皮细胞通透性增高，仍然缺乏有效的措施。丁酸钠（Sodium butyrate，NaB）作为一种常见的短链脂肪酸，由肠道菌群对纤维性食物的消化间接产生。以往的研究表明，丁酸钠可通过抑制缺氧及炎症因子，在动脉粥样硬化和血管重构的防治中发挥重要作用。另外，丁酸钠在维持血管细胞屏障功能方面也起作用，能上调紧密连接蛋白，维持正常的血管内皮通透性。丁酸钠在血管疾病中的应用前景，已得到广泛关注。但是，丁酸钠对缺氧所致的血管内皮细胞通透性增高是否产生影响以及作用机制如何，尚不明确。本课题旨在研究丁酸钠在缺氧所致人脐静脉内皮细胞通透性改变中的作用，并对其机制进行初步探讨。
　　方法：
　　人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分为常氧组、缺氧组和缺氧+丁酸钠组（n=3）。采用三气培养箱复制缺氧（1％O2）HUVEC模型，常氧组（21%O2） HUVECs于CO2培养箱中培养。
　　1.采用transwell小室分析HUVECs通透性；免疫荧光实验采用cy5-BSA检测HUVECs跨细胞通透性改变。
　　2.免疫印迹实验检测 p120、β-catenin蛋白表达；免疫荧光实验观察p120蛋白表达。
　　3.通过CHX抑制蛋白合成和MG-132抑制蛋白降解，检测p120蛋白表达。
　　4. Carboxy-PTIO抑制 NO，检测 p120蛋白表达。转染siRNA（eNOS），检测p120蛋白表达。
　　5.免疫印迹实验检测 eNOS蛋白表达；一氧化氮检测试剂盒检测细胞上清液和细胞蛋白 NO水平；免疫荧光实验检测p120和eNOS的定位。
　　结果：
　　1.丁酸钠对缺氧所致人脐静脉内皮细胞通透性改变的影响：缺氧12h时，培养的人脐静脉内皮细胞通透性显著增高，与常氧组相比，差异具有统计学意义（ P＜0.05）；与单纯缺氧组相比，缺氧+丁酸钠（1mmol/L）组人脐静脉内皮细胞通透性显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光实验观察缺氧组和缺氧+丁酸钠（1mmol/L）组人脐静脉内皮细胞cy5-BSA荧光强度与常氧组相比，没有明显差异。2.丁酸钠对缺氧条件下人脐静脉内皮细胞p120蛋白的影响：缺氧12h条件下，人脐静脉内皮细胞p120蛋白表达显著降低，与常氧组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），而β-catenin蛋白表达与常氧组相比，差异不明显（P＞0.05）；与单纯缺氧组相比，缺氧+丁酸钠（1mmol/L）组人脐静脉内皮细胞 p120蛋白表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与单纯缺氧组相比，缺氧+丁酸钠（1mmol/L）组人脐静脉内皮细胞p120蛋白荧光强度增加。
　　3.缺氧条件下p120蛋白稳定性的变化：缺氧12h条件下，缺氧+MG-132（25μmol/L）组人脐静脉内皮细胞 p120蛋白表达显著增高，与单纯缺氧组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；放线菌酮抑制蛋白合成实验结果显示：常氧组人脐静脉内皮细胞p120蛋白的半衰期为16h，缺氧组人脐静脉内皮细胞 p120蛋白的半衰期为11h，而缺氧+丁酸钠（1mmol/L）组人脐静脉内皮细胞p120蛋白的半衰期为25h。
　　4. NO在缺氧 p120蛋白表达变化中的作用：缺氧+Carboxy-PTIO（0.3mmol/L）组与缺氧组相比，p120蛋白表达水平显著增高，差异具有计学差异（P＜0.05）。
　　5. eNOS在缺氧p120蛋白表达变化中的作用：缺氧12h条件下，转染siRNA（eNOS）后检测，人脐静脉内皮细胞p120蛋白表达与对照siRNA转染组相比，明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　6.丁酸钠对缺氧所致人脐静脉内皮细胞eNOS蛋白表达以及NO分泌的影响：缺氧12h条件下，缺氧+丁酸钠组人脐静脉内皮细胞 eNOS蛋白表达与单纯缺氧组相比，差异不明显（P＞0.05）；常氧组、缺氧组、缺氧+丁酸钠组，细胞培养上清液及细胞蛋白 NO水平无明显统计学差异（P＞0.05）。
　　7.丁酸钠对缺氧所致人脐静脉内皮细胞eNOS/p120共定位变化的影响：缺氧12h条件下，与单纯缺氧组相比，缺氧+丁酸钠（1mmol/L）组人脐静脉内皮细胞eNOS/p120荧光重合部位减少。
　　结论：
　　1.缺氧导致人脐静脉内皮细胞通透性增加，丁酸钠对所缺氧致人脐静脉内皮细胞通透性增加具有抑制作用。
　　2.缺氧导致人脐静脉内皮细胞 p120蛋白表达降低，而丁酸钠可显著提高缺氧人脐静脉内皮细胞p120蛋白表达，提示丁酸钠对缺氧所致人脐静脉内皮细胞通透性的保护作用是通过上调人脐静脉内皮细胞p120蛋白表达来实现的。
　　3.丁酸钠可提高 p120蛋白稳定性，上调缺氧组人脐静脉内皮细胞p120蛋白表达；
　　4. eNOS蛋白水平降低促进缺氧条件下p120表达下调；降低NO水平抑制缺氧所致p120蛋白的下调。
　　5.丁酸钠对缺氧条件下eNOS表达和NO产生没有显著影响，提示有其它NO相关机制介导丁酸钠对缺氧人脐静脉内皮细胞p120表达下调的抑制作用。

目录

封面

声明

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 丁酸钠对缺氧血管内皮细胞通透性改变的影响

1 材料和方法

1.1材料

1.2 方法

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 transwell检测通透性

2.2 cy5-BSA检测跨细胞通透性

3讨论

第二部分 丁酸钠对缺氧血管内皮细胞粘附连接蛋白表达的影响

1 材料和方法

1.1材料

1.2 方法

1.3 统计学处理

2 结果

2.1免疫印迹技术检测结果

2.2免疫荧光技术检测结果

3 讨论

第三部分 丁酸钠调节缺氧致血管内皮细胞通透性增加机制的初步研究

1 材料和方法

1.1材料

1.2 方法

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 缺氧条件下p120蛋白稳定性的变化

2.2 NO在缺氧p120蛋白表达变化中的作用

2.3 eNOS在缺氧p120蛋白表达变化中的作用

2.4 丁酸钠对eNOS蛋白表达以及NO分泌的影响

2.5丁酸钠导致eNOS/p120共定位变化

3 讨论

参考文献

文献综述: eNOS-NO在血管内皮细胞通透性中的作用及机制研究进展

致谢

硕士期间发表的论文