内质网应激在X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良发病机制中的作用

摘要

目的：
　　采用慢病毒介导的LV-siSEDL沉默人软骨细胞（HC-a）中SEDL基因的表达，观察SEDT细胞模型中是否有内质网应激（ERS）的产生及其信号通路激活情况，初步探索ERS在SEDT发病机制中的作用。
　　方法：
　　实验分为3组：空白对照组（加PBS的HC-a）、LV-组（转染空载慢病毒的HC-a）、LV组（转染干扰慢病毒LV-siSEDL的HC-a）。
　　（1）不同浓度（0-10ug/ml）的嘌呤霉素（Puro）作用于人软骨细胞（HC-a）12h、24h、48h、72h和96h，采用最小抗生素浓度的Puro筛选转染慢病毒的细胞株。
　　（2）QPCR、Western Blot分别检测SEDL mRNA、Sedlin蛋白表达水平，确定SEDT细胞模型是否建立成功。
　　（3）QPCR检测ERS信号通路上相关应激信号分子mRNA表达水平，观察基因水平上是否有ERS产生及信号通路随时间的激活情况。
　　（4）根据QPCR的结果，采用Western Blot从蛋白水平上验证是否有ERS产生及信号通路随时间的激活情况。
　　（5）采用Annexin-FITC/PI双染法检测HC-a的凋亡率。
　　结果：
　　（1）确定Puro72h杀死所有HC-a的最小抗生素浓度为5ug/ml。
　　（2）病毒转染4天，LV组SEDL mRNA及Sedlin蛋白相对表达量分别为（0.27±0.02）、（0.05±0.01），与LV-组及空白对照组相比显著下调（P<0.001），成功构建了SEDT细胞模型。
　　（3）病毒转染4天，LV组各应激信号分子mRNA相对表达量与LV-组及空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；病毒转染5天， LV组XBP-1、ATF-6 mRNA相对表达量分别为（2.25±0.17）、（1.40±0.08），与LV-组及空白对照组相比明显上调（P<0.05）；病毒转染6天，LV组 GRP78、ATF-4、CHOP mRNA相对表达量分别为（1.75±0.16）、（1.82±0.14）和（2.73±0.21），与LV-组及空白对照组相比显著上调（P<0.01）。而LV组NFKBIA、NFKB-1及RELA mRNA相对表达量与LV-组及空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　（4）病毒转染4天，LV组GRP78蛋白相对表达量为（3.09±0.09），与LV-组及空白对照组相比明显上调（P<0.001），随后逐渐下降；病毒转染6天，LV组ATF-4蛋白相对表达量为（0.61±0.03），与LV-组及空白对照组相比显著上调（P<0.001）；而 CHOP蛋白相对表达量随着病毒转染时间的延长逐渐上调，且LV组CHOP蛋白相对表达量与LV-组及空白对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.01）。
　　（5）病毒转染6天，与LV-组（4.60±0.23）％及空白对照组（3.89±0.15）%相比，LV组凋亡率（9.78±0.56）%显著上调（P<0.05）。
　　结论：
　　初步证实SEDT细胞模型中有内质网应激（ERS）的发生，而且是通过激活未折叠蛋白反应（UPR）中的PERK/eIF2α/ATF-4信号通路，最终诱导HC-a凋亡在SEDT的发病机制中发挥作用。

目录

封面

声明

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

1 材料

1.1 细胞与病毒

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 试剂配制

2 方法

2.1 细胞培养

2.2 确定嘌呤霉素（ Puro）筛选HC-a的最小抗生素浓度

2.3 QPCR检测各基因mRNA的表达水平

2.4 Western blot检测三组细胞sedlin、GRP78、ATF-4及CHOP蛋白表达水平

2.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 确定嘌呤霉素（Puro）筛选HC-a最小抗生素浓度

3.2 各基因 Real-time PCR标准曲线的建立

3.3 Real-time PCR、Western blot分别检测SEDL及Sedlin表达水平

3.4 Real-time PCR检测ERS相关信号分子mRNA表达水平

3.5 Western blot检测GRP78、ATF-4及CHOP蛋白表达水平

3.6 Annexin-FITC/PI双染法检测ERS对人软骨凋亡的影响

4 讨论

5 结论

全文总结

参考文献

文献综述:内质网应激在多种软骨发育异常发病机制的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文