ZEB1调控外泌体相关miRNA的表达及其在肝癌血管生成中的作用

摘要

血管新生在肿瘤的发生发展中至关重要，许多因子通过影响内皮细胞而调节血管生成。越来越多的证据表明外泌体及外泌体相关的miRNAs是肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用的通讯分子。ZEB1在许多生理病理过程中发挥重要作用,但其在肿瘤包括肝癌中，对于血管生成的影响研究很少。内皮细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，我们的研究目的旨在揭示异常表达 ZEB1的肝癌细胞是否通过分泌外泌体来影响内皮细胞进而影响肿瘤血管生成。
　　本文首先建立了过表达 ZEB1的肝癌细胞系包括 HepG2-ZEB1、Hep3B-ZEB1、SMMC-7721-ZEB1，检测细胞培养上清中外泌体对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖、迁移、成管的影响。我们利用Transwell和 Tube formation实验证明 HepG2-ZEB1、 Hep3B-ZEB1、SMMC-7721-ZEB1来源的外泌体处理HUVECs能够促进其迁移和成管作用。同时，CCK8和EDU细胞活力和增殖检测发现ZEB1对HUVECs的增殖无明显影响。
　　此外，本文研究了原发性肝癌病人血清中的外泌体对HUVECs功能的影响。首先，我们对患者血清外泌体相关miRNAs进行测序分析，结果发现与正常人相比，原发性肝癌病人血清外泌体中有5个miRNAs表达上调，分别是 miR-7641、miR-4497、miR-1290、miR-1261和miR-1246。Q-PCR检测发现其中miR-7641、miR-4497和miR-1290在部分肝癌细胞系中表达较高，而在HUVECs中表达较低。值得注意的是，在肝癌细胞系SMMC-7721中分别过表达miR-7641、miR-4497和miR-1290,收集细胞培养上清中的外泌体处理 HUVECs细胞能够明显促进其成管和迁移，因此我们选定这三种miRNAs作为后续研究对象。接下来，通过在线软件预测miRNA的靶基因以及Q-PCR检测，结果显示在HUVECs细胞中miR-7641能够下调CBLB、CBLC、CDH1、TSC1、SMAD4的表达，miR-4497能够下调CBLB、CBLC、CDH1、MAP2K4、FAS、TSC1、NF1、SMAD4、PIK3R1、PTEN、EP300的表达，miR-1290能够下调CBLB、CBLC、CDH1、MAP2K4、TSC1、SMAD4、PIK3R1的表达，其中 CDH1、MAP2K4、TSC1、SMAD4、EP300与内皮功能密切相关。
　　综上所述，在肝癌微环境中，ZEB1通过影响肿瘤细胞外泌体及其相关miRNA的旁分泌，靶向调控受体细胞例如内皮细胞，进而影响内皮细胞的迁移和血管生成。我们的研究进一步揭示了肿瘤微环境中各组分间的相互作用及其影响肝癌发生发展的新机制，有助于为未来肝癌的诊断和治疗提供新的策略。

目录

封面

声明

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

第一节 肿瘤微环境的概述

第二节 外泌体及相关miRNA在肿瘤血管生成中的作用

第三节 ZEB1的概述及其在血管生成中的作用

第二章 实验材料与实验仪器

第一节 实验仪器

第二节 实验材料

第三节 实验试剂

第三章 实验方法

第一节 测序前样品处理

第二节 细胞培养

第三节 分子克隆

第四节 慢病毒包装

第五节 稳定细胞系的建立

第六节 Western Blot

第七节 Real-time PCR

第八节 Transwell实验

第九节 CCK-8检测细胞增殖

第十节 HUVECs的血管形成实验（Tube formation）

第四章 实验结果

第一节 ZEB1促进肝癌血管新生

第二节 原发性肝癌特异性外泌体相关miRNAs的鉴定

第五章 讨论

结论

参考文献

文献综述: MicroRNA在肝癌发生发展作用的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文