IRSp53在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其恶性生物学行为中的作用

摘要

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，虽然在我国其发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，但是其死亡率却高居三大恶性肿瘤之首。卵巢癌死亡率高与以下因素有关：
　　1）尽管癌抗原125（cancer antigen125,CA125）和人附睾蛋白4(human epididymis protein4，HE4)联合对诊断卵巢癌有较大临床价值，但卵巢位于盆腔内，解剖位置较深，当其发生病变时，患者常无自觉症状导致患者就诊不及时，70%以上的患者就诊时卵巢癌已进展到中晚期；
　　2）卵巢癌易发生盆腹腔扩散和远处转移。近年来，患者通常接受以理想的肿瘤细胞减灭术为基础的联合放化疗、靶向治疗的综合治疗，但是卵巢癌的复发率仍然居高不下；
　　3）卵巢癌易产生耐药。已有研究发现，卵巢癌对铂类和紫杉醇等一线化疗药物耐药；
　　4）卵巢癌的发病机制不清楚，靶向治疗研究落后。卵巢癌的侵袭转移是临床医护人员和科研工作者所面临的巨大挑战。卵巢组织成分复杂，卵巢肿瘤病理类型很多，上皮性卵巢肿瘤占原发性卵巢肿瘤的60%左右，而上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）占卵巢恶性肿瘤的85%以上。因此，探讨EOC侵袭转移机制、寻找高效的靶向治疗靶点具有非常重要的意义。
　　恶性肿瘤的发生发展是一个多因素调控的复杂过程，与细胞的迁移能力、肿瘤血管生成、肿瘤微环境、细胞增殖及凋亡调控等有关。近年来，细胞的迁移能力与肿瘤侵袭转移之间的相关性成为研究的热点。研究表明，肿瘤的侵袭转移与细胞的迁移能力呈正相关。细胞的迁移依赖于伪足的形成，丝状伪足和板状伪足是肌动蛋白动力学的结构基础，参与细胞骨架重排，而细胞骨架重排为细胞的迁移提供动力。研究发现，胰岛素受体酪氨酸激酶底物p53蛋白（insulin receptor tyrosine linase substrate p53，IRSp53）是一个控制细胞迁移能力的关键蛋白，可介导伪足的形成。IRSp53含有I-BAR（Inverse-Bin-Amphiphysin-Rvs）、CRIB(Cdc42/Rac-interactive binding motif)、SH3(Src homology3)及WH2(WASP-homology2)结构域，其中I–BAR结构域能够与细胞膜结合产生负向的向外的膜突起，参与丝状伪足和板状伪足的形成；WH2结构域能够与肌动蛋白结合，提示其参与调节肌动蛋白动力学；SH3结构域能够与WAVE、Mena和Eps8等肌动蛋白动力学调节蛋白的富含脯氨酸序列结合调节肌动蛋白动力学；CRIB结构域与小GTP酶Cdc42/Rac发生相互作用。因此，认为IRSp53在调节肌动蛋白动力学和细胞膜形态学中发挥重要的作用。课题组前期研究显示，WAVE和Rac1在上皮性卵巢癌中高表达并可作为早期诊断和判断预后的分子指标；同时还发现上皮性卵巢癌中可能存在Cdc42/Rac1-IRSp53-WAVE信号通路。本研究拟探讨IRSp53在上皮性卵巢癌中的表达，应用RNAi技术沉默IRSp53，研究其在卵巢癌增殖、侵袭及转移等恶性生物学行为中的作用，以期为卵巢癌的靶向治疗提供新的可能靶点。
　　第一部分IRSp53在上皮性卵巢肿瘤中的表达及临床意义
　　目的：
　　检测IRSp53在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达，探讨IRSp53的表达与上皮性卵巢肿瘤患者临床病理特征及预后的关联性。
　　方法：
　　（1）采用免疫组织化学技术检测IRSp53在22例正常卵巢组织、16例良性卵巢肿瘤组织、15例交界性卵巢肿瘤组织和78例上皮性卵巢癌组织中的表达，分析IRSp53的表达与上皮性卵巢肿瘤患者临床病理特征之间的关系。
　　（2）采用Western blotting技术检测IRSp53在8例正常卵巢组织、11例良性卵巢肿瘤组织、11例交界性卵巢肿瘤组织和23例上皮性卵巢癌组织中的表达。
　　（3）采用Kaplan-Meier分析IRSp53的表达对上皮性卵巢肿瘤患者预后的影响。
　　结果：
　　（1）免疫组化结果显示，IRSp53在49例（62.82%）上皮性卵巢癌组织中呈高表达，29例（31.78%）低或无表达；而在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织、交界性卵巢肿瘤组织中主要为低或无表达，高表达分别为1例（4.55%），3例（18.75%）和4例（26.67%），与上皮性卵巢癌相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。在上皮性卵巢癌中，IRSp53的表达与肿瘤的FIGO分期、肿瘤分化程度、术后残余肿瘤直径及血清CA125水平有关。IRSp53在FIGOⅢ/Ⅳ期上皮性卵巢癌中的表达明显高于 FIGOⅠ/Ⅱ期组织（P＜0.05），在中低分化的上皮性卵巢癌组织中的表达高于高分化者（P＜0.05），在术后残余肿瘤直径满意（<1cm）的上皮性卵巢癌组织中的表达高于术后残余肿瘤直径不满意（>1cm）者(P＜0.05)，在患者血清CA125水平高（>35U/ml）的上皮性卵巢癌中的表达高于患者血清CA125水平低（<35U/ml）者（P＜0.05）。但是IRSp53的表达与上皮性卵巢癌患者年龄、腹水量和肿瘤大小、单双侧及病理学类型无关（P＞0.05）。
　　（2）Western blotting结果显示，IRSp53在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织、交界性卵巢肿瘤组织和上皮性卵巢癌组织中的表达分别为0.240±0.050,0.308±0.354,0.467±0.135和1.203±0.080，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　（3）Kaplan-Meier分析结果显示，IRSp53高表达的上皮性卵巢癌患者总生存期明显低于IRSp53低表达的患者（P＜0.05）。
　　结论：
　　IRSp53在上皮性卵巢癌组织中呈高表达，IRSp53高表达与上皮性卵巢癌患者肿瘤FIGO分期晚、低级别分化，不满意的肿瘤细胞减灭术和患者的不良预后有关，提示IRSp53可能在上皮性卵巢癌的发生发展中发挥重要的作用。
　　第二部分IRSp53 shRNA慢病毒载体的构建及稳定转染SKOV3细胞的筛选
　　目的：
　　设计、构建IRSp53的shRNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒包装载体，筛选稳定转染的SKOV3细胞株，为后续的细胞功能学实验奠定实验基础。
　　方法：
　　（1）设计并合成三条含高效特异性靶向IRSp53基因的shRNA序列（IRSp53 shRNA-1，-2，-3）和一条阴性对照序列并对重组质粒进行鉴定。
　　（2）将测序正确的重组质粒与PV112转染293T细胞，收集、提纯，测定病毒滴度。将包装好的质粒转染SKOV3细胞，培养72h后，Real-time PCR检测IRSp53的表达，筛选最佳干扰靶点。
　　（3）Real-time PCR验证稳定转染的SKOV3细胞的IRSp53的表达。
　　结果：
　　（1）DNA序列测定结果表明，IRSp53 shRNA慢病毒重组质粒构建成功。
　　（2）成功建立并筛选出稳定转染IRSp53 shRNA的SKOV3细胞。
　　（3）Real-time PCR结果显示，IRSp53 RNAi1靶点干扰效果优于其他靶点，mRNA表达显著下调，与空白对照组比差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　成功构建了IRSp53基因的特异性重组质粒，并筛选出高效的靶向干扰IRSp53的RNAi序列；成功建立了稳定转染的SKOV3细胞株，为进一步研究IRSp53对SKOV3卵巢癌细胞株增殖、侵袭等恶性生物学行为的调控奠定实验基础。
　　第三部分沉默IRSp53对卵巢癌细胞株SKOV3细胞恶性生物学行为的影响
　　目的：
　　探讨RNAi沉默IRSp53基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖能力、侵袭能力及迁移能力等的影响。
　　方法：
　　（1）MTT实验检测RNAi沉默IRSp53基因前后SKOV3细胞的增殖能力。
　　（2）Transwell实验检测RNAi沉默IRSp53基因前后SKOV3细胞的纵向迁移能力。
　　（3）划痕实验（伤口愈合实验）检测RNAi沉默IRSp53基因前后SKOV3细胞的横向迁移能力。
　　（4）软琼脂克隆形成实验检测RNAi沉默IRSp53基因前后SKOV3细胞群体增殖能力及依赖性。
　　结果：
　　（1）MTT实验结果显示，干扰组（SKOV3–KD）与空转染组（SKOV3–CON）、阴性对照组（SKOV3–NC）相比，细胞的增殖受到抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05），RNAi沉默IRSp53基因抑制细胞的增殖能力。
　　（2）Transwell实验结果表明，SKOV3–KD组穿膜细胞数较SKOV3-CON组和 SKOV3-NC组显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05），RNAi沉默IRSp53基因抑制细胞的纵向迁移能力。
　　（3）划痕实验结果显示，SKOV3–KD组细胞伤口愈合缓慢，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），RNAi沉默IRSp53基因抑制细胞的横向迁移能力。
　　（4）软琼脂克隆形成实验结果显示，21天后，SKOV3–KD组细胞形成的克隆数减少且克隆直径小（P＜0.05），RNAi沉默IRSp53基因抑制细胞群体增殖能力。
　　结论：
　　RNAi沉默IRSp53基因后，卵巢癌SKOV3细胞增殖能力、侵袭能力和迁移能力下降，提示IRSp53可能在上皮性卵巢癌的发生、侵袭和转移等恶性生物学行为中发挥重要作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分IRSp53在上皮性卵巢肿瘤中的表达及临床意义

1.1 材料

1.2 方法

1.3 统计学方法

2.2 Western blot 检测IRSp53在上皮性卵巢肿瘤中的表达

2.3 IRSp53的表达与EOC患者临床病理特征之间的关系

2.4 IRSp53的表达与EOC患者预后的关系

3 讨论

4 小结

第二部分IRSp53 shRNA 慢病毒载体的构建及稳定转染SKOV3细胞的筛选

1.1 材料

1.2 方法

1.3 统计学方法

2.3 筛选稳转SKOV3细胞株

2.4 Real–Time PCR验证抑制效率

3 讨论

4 小结

第三部分沉默IRSp53对卵巢癌SKOV3细胞恶性生物学行为的影响

1.1 材料

1.2 方法

1.3 统计学分析

2.2 沉默IRSp53抑制细胞的纵向迁移能力

2.3 沉默IRSp53抑制细胞的横向迁移能力

3 讨论

4 小结

全文总结

参考文献

文献综述:I- BAR结构域家族蛋白在肿瘤研究中的进展

致谢

攻读硕士期间发表的论文