铜绿假单胞菌伴轻型链球菌急性肺部感染对宿主TLR4途径的影响

摘要

第一部分 铜绿假单胞菌伴轻型链球菌感染对宿主TLR4影响的体内研究 目的：铜绿假单胞菌是院内感染最重要的机会致病菌之一;在本课题组前期研究中发现其常与轻型链球菌共同存在于机械通气新生儿呼吸道;而TLR4是广泛表达于肺支气管上皮细胞表面识别病原菌的受体;因此我们猜想TLR4在铜绿假单胞菌伴轻型链球菌肺部感染中有重要作用;动物体内实验的目的主要在于探究铜绿假单胞菌和轻型链球菌急性肺部感染对宿主TLR4途径的影响。 方法：利用C57正常小鼠和TLR4缺陷小鼠分别予以单独铜绿假单胞菌野生株PAO1感染;单独轻型链球菌标准株S. mitis感染;PAO1+S. mitis混合感染;以及PBS缓冲液处理（对照组）建立小鼠急性肺部感染模型;通过肺组织细菌学和病理学分析;肺泡灌洗液（BALF）细胞计数和分类计数以及相关细胞因子IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10的检测;观察和测定不同处理组所引起的宿主免疫反应。 结果：PAO1单独感染正常小鼠后;引起宿主严重的免疫反应;伴随着肺组织局部免疫细胞浸润;肺组织明显损伤和坏死;BALF中细胞总数明显升高;IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10的蛋白表达量明显升高（P<0.05）;而PAO1+S. mitis混合后感染小鼠;会刺激小鼠产生明显的免疫反应;但是较单独PAO1感染为轻;肺组织可见炎性细胞浸润;小片状或点状坏死。PAO1单独感染组IL-6和TNF-α的蛋白表达量也明显升高;但是相比单独PAO1感染组较轻;IL-10则升高不明显而IL-4则明显降低。另外;单独S. mitis感染组和PBS缓冲液处理相似;宿主无明显的炎症反应;肺组织红润;未见明显的炎性浸润和组织损伤表现;相关细胞因子也未见明显异常变化。另外;TLR4缺陷小鼠在经过不同细菌感染之后;肺组织病理与正常小鼠表现相似但更加严重;BALF中细胞因子IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10的含量明显降低;与PBS处理组相近。 结论：铜绿假单胞菌伴轻型链球菌混合感染可刺激小鼠产生明显的免疫反应;但引起的肺组织炎症反应有一定程度的减轻;且促炎因子都有明显下降;说明轻型链球菌能抑制铜绿假单胞菌引发的急性肺部炎症。而在TLR4缺陷小鼠中;铜绿假单胞菌伴轻型链球菌混合感染与铜绿假单胞菌单独引起的IL-6、TNF-α分泌并无明显差异;因此铜绿假单胞菌伴轻型链球菌混合感染中TLR4受体途径可能发挥着重要作用。 第二部分 铜绿假单胞菌伴轻型链球菌感染对人正常支气管上皮细胞的影响 目的：体内实验已证明轻型链球菌能减弱机体对铜绿假单胞菌感染引起的组织损伤;并能减少炎症介质的产生。上皮细胞是呼吸道固有免疫的重要组成部分;且TLR4是支气管上皮细胞识别病原菌的重要分子;本部分研究主要探讨S.miti和PAO1混合感染对人正常支气管上皮细胞的致病性;以及其共同作用是否影响上皮细胞TLR4的表达。方法：将实验分组分为PAO1组、S. mitis组和PAO1+S. mitis组、PBS对照组。将各组细菌按不同比例（MOI=1、MOI=10、MOI=100）小心滴加入人支气管上皮细胞（BEAS-2B）;处理1 h、3 h、6 h后观察各组实验指标。光学显微镜观察细胞形态改变;RT-PCR检测检测细胞IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β、TLR4的表达。 结果：与单独PAO1处理组比较;PAO1+S. mitis混合处理细胞形态损伤更轻;细胞皱缩程度更小;细胞碎片更少。与单独PAO1处理组相比较;S. mitis与 PAO1混合刺激BEAS-2B细胞;感染1 h;检测促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α无明显差异;感染3 h;IL-6、IL-8、TNF-α明显降低;差异有统计学意义(P<0.05);且BEAS-2B细胞TLR4的表达显著降低（P<0.05）。 结论：轻型链球菌与铜绿假单胞菌混合感染时;轻型链球菌会减轻铜绿假单胞菌对BEAS-2B细胞的损伤及炎症反应;此现象可能是通过下调BEAS-2B细胞TLR4的表达来实现的。 第三部分 铜绿假单胞菌伴轻型链球菌急性肺部感染的机制研究 目的：体内实验和细胞实验已经证明铜绿假单胞菌伴轻型链球菌混合感染引起的机体免疫反应较单独铜绿假单胞菌为轻;除了本文第一部分提出的IL-4/10协同抑制巨噬细胞分泌IL-6;以及第二部分提出的轻型链球菌可能通过促进抑炎因子TGF-β的分泌来减轻PAO1和S.mitis混合组的炎症反应;本部分继续对上述现象相关机制进行初步探讨。方法：铜绿假单胞菌野生株PAO1和轻型链球菌标准株S. mitis 体外共培养;比较其与单独PAO1培养的PAO1菌落计数;用氯仿萃取法测定PAO1的毒力因子绿脓毒素的含量;利用C57正常小鼠和TLR4缺陷小鼠分别予以单独LPS感染组;单独S. mitis感染组;LPS+S. mitis混合感染组;PBS缓冲液处理组（对照组）建立小鼠急性肺部感染模型;通过小鼠肺组织H&E染色分析;光学显微镜观察细胞形态学改变; RT-PCR检测细胞IL-6、TNF-α的表达。 结果：S. mitis与PAO1体外共培养并不影响PAO1的生长;S. mitis与PAO1混合培养组绿脓毒素的分泌显著高于PAO1单独组;差异有统计学意义 (P<0.05)。体内实验发现LPS引起的肺部炎症最重;LPS+S. mitis组引起中等程度的肺部炎症;S. mitis则基本不引起肺部炎症。单独LPS感染组可以明显诱导IL-6和TNF-α的表达;而LPS+S.mitis混合感染组与单独LPS感染组比较; IL-6和TNF-α的mRNA表达量明显减低(P<0.05)。 结论：轻型链球菌并未通过竞争性抑制铜绿假单胞菌的生长、降低其毒力因子水平来减轻炎症反应;相反;还能促进铜绿假单胞菌毒力因子绿脓毒素的分泌。轻型链球菌可以减轻LPS肺炎模型的炎症反应;抑制TLR4相关炎症介质的表达;这可能是轻型链球菌减轻铜绿假单胞菌炎症反应的机制之一。

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第一部分 铜绿假单胞菌伴轻型链球菌急性肺部感染对宿主TLR4影响的体内研究

1.1 实验菌株

1.2 实验动物

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