斑马鱼mmp21基因在胚胎左右不对称发育中作用的初步研究

摘要

目的：
　　探讨敲低基质金属蛋白酶21(matrix metallopeptidase21，mmp21)基因对斑马鱼胚胎左右不对称发育的影响。
　　方法:
　　在斑马鱼胚胎1~2细胞期显微注射吗啉反义寡核苷酸（morpholino antisense oligonucleotides，MO）敲低mmp21基因的表达。
　　（1）逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）检测mmp21 MO的有效性。
　　（2）利用整胚原位杂交(whole mount RNA in situ hybridization，WISH)检测心脏和心外器官（肠道、脑）标志物以评价斑马鱼胚胎左右不对称发育情况。
　　（3）通过观察活体胚胎心脏、计数心率和测量心室收缩分数(ventricular shortening fraction，VSF)评价心脏功能的改变。
　　（4）体视显微镜下观察活体胚胎库氏囊泡（Kupffer's vesicle，KV）并拍照，利用Image J测量KV面积。
　　（5）通过整胚原位免疫荧光（whole mount in situ immunofluorescence）对乙酰化微管蛋白（acetylated-tubulin，AC-tubulin）染色以评价纤毛变化。
　　（6）通过WISH检测中线屏障标志物以观察中线屏障的改变。
　　结果：
　　mmp21 MO能有效敲低mmp21基因。敲低mmp21基因导致斑马鱼胚胎心脏、肠道以及脑部标志物左右随机分布，随着 mmp21 MO浓度的增高，异常比例增高；活体胚胎心脏结构异常，表现为心房、心室左右随机分布；心脏功能损害，表现为心率减慢、心室收缩分数减少（P＜0.05）；KV面积变小（P＜0.05），囊泡内运动纤毛数量减少、长度变短（P＜0.05）；中线分子屏障lefty1部分或全部缺失。
　　结论：
　　敲低mmp21基因导致斑马鱼心脏和其他心外结构（肠道、脑部）左右不对称发育异常以及器官功能损害，其可能与左右不对称发育关键结构KV和纤毛缺陷，以及中线分子屏障缺失有关。本研究以斑马鱼为模式动物初步探讨mmp21基因在胚胎左右不对称发育中的作用，为今后深入研究mmp21基因奠定了基础，同时也为 mmp21基因在人类胚胎发育中的作用带来新的启示。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1 mmp21 MO效果的验证

2.2敲低mmp21基因影响斑马鱼心脏左右不对称发育

2.3敲低mmp21基因导致斑马鱼心脏功能受损

2.4敲低mmp21基因影响斑马鱼心外器官左右不对称发育

2.5敲低mmp21基因对KV及纤毛的发生的影响

2.6敲低mmp21基因导致斑马鱼中线分子屏障缺失

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:胚胎左右不对称发育及相关疾病的概述

致谢

攻读研究生期间发表的学术论文及参加的课题