全基因组功能性非编码RNA筛选系统的构建与验证

摘要

随着大规模高通量测序技术的迅猛发展，越来越多的研究表明非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）在疾病调控和发生发展中发挥着非常重要的作用。目前，研究最多的功能ncRNA是发挥RNA干扰（RNA interference，RNAi）作用的microRNA和siRNA。但作为ncRNA家族中重要一员的长链非编码RNA（Long non-codng RNA,LncRNA），不仅在数量上占全部ncRNA的近80%，而且可通过和靶基因组成复杂的调控网络共同调节有机体的各种活动，如转录和翻译调控、转录后的表观遗传学修饰、控制细胞周期、细胞分化和细胞凋亡等。LncRNA在基因组中广泛存在，其表达水平的改变甚至是空间结构变化都可引起一系列蛋白表达和信号通路状态的变化。
　　以DNA为模版的RNA转录由三种不同的RNA聚合酶（RNA Pol I、II和III）完成。RNA Pol II能够对mRNA和ncRNA转录，但RNA Pol I和RNA Pol III迄今仅被发现可以转录ncRNA。本研究室在运用两个相向排列的RNA Pol III型启动子U6和 H1载体，成功构建随机siRNA干扰文库的基础上，遵循同样的思路自行设计并建立了以人基因组 DNA衍生的ncRNA文库。通过将被随机打断的人基因组DNA片段插入到双启动子之间，成功构建了能够进行全基因组筛选的ncRNA文库。
　　为了确保文库的构建质量，我们利用Gibson Assembly（GA）体外同源重组拼接技术，弥补了经典分子克隆方法在构建文库中的不足。该ncRNA质粒文库一次组装数目约2.3×106，完成5次Gibson Assembly即可达到1.2×107的文库库容。随机挑选8个阳性克隆的菌落PCR和DNA测序分析证实了ncRNA文库的多样性和代表性。为了验证新构建的ncRNA文库的功能，我们尝试利用ncRNA文库筛选人黑色素瘤细胞系A375中表达水平被特异性上调或下调后引起对维罗菲尼耐药的基因。
　　我们发现亲本A375对维罗菲尼的致死浓度为10μM。将ncRNA质粒文库包装为逆转录病毒文库并感染亲本A375细胞后，亲本A375细胞接受致死浓度10μM维罗菲尼的筛选。早期，成功感染文库的A375细胞大量死亡，但少部分存活细胞慢慢长出一些集落，将这些筛选后存活的混合池细胞命名为A375/HL。我们发现和亲本A375细胞相比，耐药细胞A375/HL形态狭长、呈梭形，呈间充质样形态改变；A375/HL细胞对维罗菲尼的敏感性降低。WST-1检测显示，亲本A375对维罗菲尼的半数抑制浓度为4.17μM，A375/HL对维罗菲尼的半数抑制浓度为8.76μM。在浓度为1μM的维罗菲尼作用下，A375/HL细胞的克隆形成能力远远大于亲本细胞A375。当30μM高浓度的维罗菲尼处理A375/HL细胞24小时后发现，耐药细胞A375/HL组更容易形成药物结晶，提示A375/HL可能比亲本细胞的药物泵出率高。
　　实时荧光定量PCR检测显示，和亲本细胞A375相比，A375/HL细胞中上皮细胞标志物E-cadherin mRNA的表达降低，其它相关的间充质标志物表达升高。利用10条肿瘤相关信号通路荧光素酶报告基因检测技术发现，接受药物处理后，A375/HL中没有被激活的信号通路，包括Elk1/SRF、AP1、Myc/Max和STAT在内的多条信号通路受到显著抑制。据报道，BRAF抑制可导致其他信号通路的适应性激活。接着我们检测了EGFR信号通路中关键激酶Akt、STAT3、MEK和Erk的磷酸化水平。通过激光共聚焦显微镜检测发现基础状态下，p-Akt、p-STAT3、p-MEK和p-Erk在A375/HL细胞中的表达水平高于亲本细胞A375，提示有包括EGFR信号通路在内的其它信号通路的代偿激活。
　　因此，我们认为利用ncRNA文库筛选出的对维罗菲尼耐药的细胞与其它研究中描述的获得性耐药细胞以及临床肿瘤耐药样本的耐药特性有共通性。这表明我们利用基于人基因组DNA衍生的 ncRNA文库进行全基因组范围内对维罗菲尼耐药的功能基因筛选是有效可行的。最后，提取耐药细胞A375/HL的基因组DNA，通过PCR将耐药细胞基因组中插入的功能ncRNA序列连入测序引物，测序前检测构建的ncRNA测序文库的质量和含量。
　　综上所述，本研究首次提出并建立了一个针对人类基因的利用基因组DNA进行文库构建的策略和功能筛选耐药基因的技术路线。这些前期研究工作显示这种文库的成功构建为规模化功能基因筛选研究提供了新的技术平台。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分人基因组 DNA 衍生的ncRNA文库的构建

1 材料与方法

2实验结果

3讨论

第二部分人基因组 DNA 衍生的ncRNA 文库筛选黑色素瘤对维罗菲尼耐药相关基因的实验研究

1 材料与方法

2 实验结果

3讨论

第三部分随机 CRISPR gRNA质粒文库的构建

1 材料与方法

2 结果

3.讨论

全文总结

参考文献

文献综述：CRISPR-Cas9文库在功能基因组学中的应用

致谢

博士期间发表的论文