Rg1延缓D-galPOF小鼠模型生殖系统病理损害、改善生殖功能及其机制的研究

摘要

目的：
　　人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)是从中药人参中提取出来的单体成分，具有抗衰老、抗氧化、抗纤维化的功能，并具有类雌激素样活性。与现在常用治疗卵巢早衰（premature ovarian failure POF）的方法激素补充治疗(menopausal hormone therapy MHT)比较副作用较小,并可能改善 POF的生殖功能。本研究采用致衰剂 D-半乳糖（D-galactose D-gal）建立POF小鼠模型，在建模过程中，当动情周期紊乱时加用Rg1进行治疗，观察其治疗效果，希望为恢复卵巢功能寻找一种新的治疗方法并探讨其作用机制。
　　方法：
　　1、建立POF小鼠模型：选取具有正常动情周期C57小鼠，分为四组，每组10只，四组分别是：正常对照组、低剂量组（D-gal100mg/kg/d）、中剂量组（D-gal200mg/kg/d）、高剂量组（D-gal300mg/kg/d）。处理过程中观察动情周期；眼眶取血测血清卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone FSH），雌二醇（Estradiol2 E2）、抗苗勒管激素（Anti-Mullerian hormone AMH）；称取小鼠体重，卵巢和子宫的重量，计算子宫卵巢的重量系数，HE染色计数各级卵泡数和黄体数，筛选出最佳建模剂量。
　　2、Rg1对生殖系统的作用：选取有正常动情周期的C57小鼠100只，分为四组，每组25只，四组分别是：生理盐水组，Rg1+D-gal组/延缓衰老组，Rg1组，D-gal组/衰老组。观察动情周期变化；眼眶取血测血清性激素；称取小鼠重量，子宫卵巢重量，计算子宫卵巢重量系数；子宫卵巢HE染色，计数各级卵泡和黄体数，观察子宫内膜厚度；子宫卵巢透射电镜观察超微结构变化；检测子宫和卵巢抗氧化指标总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase GSH-Px），氧化指标丙二醛（malondialdehyde MDA）和炎性指标白介素-1β（Interleukin-1βIL-1β）、白介素-6（interleukin-6 IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-αTNF-α）；免疫组化检测卵巢颗粒细胞上卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor FSHr）的表达，并进行定量分析；WB检测卵巢FSHr、P53、P21、P19、P16蛋白的表达量；RT-PCR检测卵巢衰老因子P53、P21、stk，子宫衰老因子Bax、bcl-2 mRNA的表达；合笼实验，每组选取10只小鼠与雄鼠合笼，计数3个分娩周期幼鼠的数量；合笼实验前后D-gal组小鼠肺、肝脏、脾、肾脏HE染色检查，比较其形态学变化。
　　结果：
　　1、复制POF小鼠模型D-gal剂量的筛选实验中，中剂量和高剂量组FSH明显升高，E2、AMH明显降低，卵泡数和黄体数都明显减少，均达到了POF的标准，故本实验后续研究采用中剂量组。
　　2、Rg1对生殖系统的作用研究结果：从注射D-gal的第三周开始衰老组动情周期紊乱，延缓衰老组在整个处理过程中动情周期无明显变化；衰老组卵巢、子宫的重量系数低于延缓衰老组，延缓衰老组与Rg1和生理盐水组无明显差异；卵巢HE染色，衰老组各级卵泡数和黄体数明显减少，延缓衰老组卵泡和黄体数恢复正常，透射电镜衰老组卵泡颗粒细胞中见大量凋亡小体，间质中见坏死组织，延缓衰老组卵泡颗粒细胞未见明显凋亡小体，间质中未见坏死组织；子宫透射电镜，衰老组子宫肌层见大量纤维化，子宫内膜变薄，延缓衰老组子宫的纤维化程度减轻，内膜见腺体结构；衰老组子宫和卵巢上抗氧化指标T-SOD、GSH-Px明显降低，氧化指标MDA明显升高；炎性指标IL-1β、IL-6、TNF-α升高；颗粒细胞上FSHr蛋白的表达量降低；卵巢上P53、P21、P19、P16蛋白表达量明显升高；卵巢上衰老基因P53、P21、stk，子宫上衰老因子Bax、bcl-2 mRNA的表达量明显升高。然而，与衰老组相比较，延缓衰老组抗氧化指标明显升高，氧化指标，炎性指标明显降低，颗粒细胞上FSHr蛋白的表达量增高，子宫和卵巢上衰老因子蛋白和mRNA的表达明显降低。延缓衰老组与生理盐水组，Rg1组在上述指标比较无明显差异。合笼实验前，衰老组肺、肝脏、肾脏、脾HE染色都有明显的炎性改变，经合笼试验这段时间的修复，衰老组肺、肝脏、肾脏、脾的炎性改变已经明显恢复，但是检测三周期分娩幼鼠的数量，衰老组分娩幼鼠的数量随分娩次数增多而逐渐减少，D-gal对生殖功能的影响并没有随时间延长而好转。但是，延缓衰老组分娩幼鼠的数量并未受影响。
　　结论：
　　Rg1通过抗氧化，抗炎性损伤减轻POF小鼠模型卵巢和子宫的病理损害，并通过上调颗粒细胞上FSHr的表达，减少颗粒细胞凋亡，抑制卵泡闭锁，下调衰老信号通路P53-P21-P19/stk、P16、Bax-bcl-2表达改善POF小鼠模型的生殖功能。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 D-gal建立POF小鼠模型

1材料与方法

2 结 果

3讨 论

参考文献

第二部分 Rg1延缓D-gal POF小鼠模型卵巢的病理损害及其机制的研究

1材料与方法

2 结 果

3讨 论

参考文献

第三部分 Rg1延缓D-gal POF模型子宫的病理损害及其机制的研究

1材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述：半乳糖的生物代谢与卵巢早衰

致谢

攻读学位期间参研课题与发表的学术论文