利用成骨细胞特异性敲除小鼠研究C/EBPα在骨发育中的作用

摘要

骨骼在机体中具有非常重要的作用，骨发育与软骨细胞和成骨细胞的分化功能密切相关。其中成骨细胞是骨发育、骨形成以及骨改建过程中的主要功能细胞，也是人体骨组织的重要组成成分，在骨形成以及骨量维持中起着关键作用。成骨细胞来源于具有多向分化潜能的间充质干细胞，后者经过细胞增殖，合成细胞外基质，逐渐成熟及矿化，最终分化成为骨细胞。间充质干细胞(MSC, mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，在生长过程中具有自我复制能力，还具有强大的多向分化潜能。其在分化过程中能够转化为脂肪、软骨、硬骨或者其他类型的细胞。骨的形成是 MSCs通过迁移、增殖、分化，在骨吸收部位形成成骨细胞，并介导新骨组织形成的过程，其中 MSCs的成骨分化是骨形成的核心过程。一旦成骨细胞分化产生异常，就会对骨发育与骨重建产生重要影响，会带来比如骨质疏松等诸多和骨代谢相关的疾病。目前临床医学和基础医学均对 MSCs成骨分化机制的研究十分关注，尤其针对调控信号和一些重要的成骨转录因子的研究已经成为该领域的热点话题，但对于 MSCs的成骨分化原理和分子机制的研究依然存在很多盲区，因此当前对临床骨代谢相关疾病的治疗存在一定的局限性。
　　C/EBPs是在对MSCs分化过程进行研究分析时发现的一种真核细胞转录调控因子，众多学者对于这种调控因子的结构和功能进行了全面的分析，又称其为增强子结合蛋白(CCAT/enhancer binding protein，C/EBP)。在之前的研究中发现 C/EBPα是促进脂肪细胞分化的重要转录因子，在脂肪细胞分化中起着重要作用。但近年来，有学者关注到同一家族的C/EBPα同时参与了脂肪细胞分化和成骨细胞分化过程，但C/EBPα在成骨细胞领域中的研究基本是空白。而在实验室的前期研究中，我们发现C/EBPα与C/EBPα相类似，在软骨细胞中被敲除后会影响软骨细胞分化和增殖，进而影响骨发育过程。但C/EBP?会不会直接影响间充质干细胞的成骨分化过程呢？于是我们使用成骨细胞条件性敲除的小鼠模型（C/EBPαf/f;Osx-cre）来进行进一步的研究。
　　本课题采用条件性基因敲除技术，建立C/EBPα在小鼠成骨细胞中进行特异性敲除的模型，从而准确研究C/EBPα在成骨细胞中缺失后对成骨分化和骨形成的影响。相比于野生型小鼠，C/EBPαf/f;Osx-cre基因敲除小鼠出生以后，就可见体型小于同窝野生型对照小鼠，并在生长过程中出现生长迟缓；小鼠8周龄时体型差别达到最大值并持续终身。同时通过uCT、X射线和组织学分析，发现C/EBPαf/f;Osx-cre基因敲除小鼠的股骨骨密度明显降低，出现皮质骨变薄，松质骨中骨小梁体积减小，骨小梁之间间距增大。通过提取新生小鼠的头盖骨细胞，采用体外培养的方式对头盖骨细胞进行培养诱导，观察成骨细胞分化过程，发现成骨细胞特异性敲除C/EBPα后会引起其碱性磷酸酶（ALP）活性降低，矿化能力减弱，并且与成骨相关的骨基质蛋白mRNA水平和蛋白表达量均下降。与体内结果一致，qRT-PCR表明大部分成骨细胞和前成骨细胞特异性基因在C/EBPα缺陷的成骨细胞中表达下降。Alp、Runx2、osterix、Atf4转录水平均低于对照组，而osteopontin、osteocalcin的转录水平无明显差异。用Western印迹方法检测也得到同样的结论，Runx2，Atf4，Osterix和Osteocalcin蛋白表达量在C/EBPα敲除组均有不同程度的下降。
　　因此我们推测C/EBPα有可能作为Runx2的协同因子，调节间充质细胞向软骨前体细胞与成骨分化，继而影响成骨分化重要转录因子Osterix、ATF4等的表达，从而促进间充质干细胞的成骨分化。但C/EBPα如何影响其分化机理和具体的调控机制还需要进一步研究。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1.间充质干细胞的成骨分化研究

2. C/EBPs的研究现状

3.条件性基因敲除动物的研究和应用

实验研究

1.实验材料

1.1实验动物

1.2实验仪器

1.3实验试剂

1.4缓冲液配方及制备方法

1.5实验耗材

2.实验方法

2.1鉴定小鼠基因型

2.2小鼠组织学分析

2.3小鼠原代成骨细胞培养及功能检测

2.4成骨细胞中基因表达量的检测

2.5小鼠骨架染色

2.6数据分析

3.实验结果

3.1 C/EBPα在软骨细胞特异性敲除后对骨发育的影响

3.2 C/EBPα在成骨细胞特异性敲除后对骨发育的影响

4.讨论和总结

参考文献

文献综述：间充质干细胞成骨分化的研究进展

致谢

博士期间发表论文