染色质重塑因子Brg1在小鼠肺纤维化中的作用及机制研究

摘要

目的： 肺纤维化（Pulmonary fibrosis; PF）是一种进展性间质肺疾病;机制不明;缺乏有效的治疗方法;死亡率高。PF病理过程复杂;多种细胞如肺泡上皮细胞、炎症细胞、成纤维细胞/肌成纤维细胞等参与其中。有研究报道;染色质重塑因子Brg1在心脏和肾脏纤维化过程中起重要作用;但在肺纤维化中的作用尚不明确。本文探讨Brg1在小鼠肺纤维化中的作用及可能的作用机制;为PF的机制研究提供可能的新靶点。 方法： 1. Brg1在小鼠肺纤维化中的表达：将C57BL/6随机分为NS（空白对照组）和BLM（PF模型组）2组;每组15只。经腹注射10%水合氯醛麻醉后;行无创气管插管法分别给予50μL NS和50μL 浓度为5mg/kg的BLM。在第21d处死小鼠并收集肺组织标本。H&E染色观察肺组织病理改变并评分;Masson染色观察肺组织胶原的沉积;IHC和Western blot检测肺组织中Brg1蛋白表达。IHC和IF检测PF肺中Brg1、肺泡表面活性物质C（SPC）、CD11b和α-SMA的表达;磁珠分选法提取小鼠原代AEC2s;IF染表面活性物质前体proSPC鉴定原代Ⅱ型肺泡上皮细胞（typeⅡalveolar epithelial cells; AEC2s）;Western blot检测原代AEC2s中Brg1蛋白表达。 2. 敲除AEC2s中Brg1对肺纤维化的影响：引进并杂交两种转基因 小 鼠 Brg1fl/fl 和 SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre ; 得 到SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre/Brg1fl/fl纯合子、SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre/Brg1fl/–杂合子及同窝野生型（WT）3种小鼠;用碱裂解法鉴定3种小鼠基因型;给予2%多西环素诱导Cre重组酶活性;靶向敲除AEC2s中Brg1基因;提取小鼠原代AEC2s;Western blot检测Brg1敲除效率;无创气管插管法给予 3 组 Brg1 基因敲除小鼠 Brg1ΔAEII/ΔAEII、Brg1ΔAEII/+和Brg1+/+BLM刺激;建模第21天处死老鼠并收取肺标本。观察小鼠生存情况;H&E染色观察肺组织病理改变并评分;Masson染色观察肺组织胶原沉积;Sircol胶原测定可溶性胶原蛋白水平。 3. 敲除AEC2s中Brg1后增加肺纤维化易感性的机制研究：IHC和Western blot检测Brg1基因敲除鼠PF模型肺组织中PCNA蛋白表达;IHC检测Brg1基因敲除鼠PF模型肺组织中SPC+细胞数量;构建小鼠肺泡上皮细胞株Mle-12细胞上干扰Brg1表达的siRNA;筛选最佳干扰序列;CCK8和BrdU检测干扰Brg1基因后对Mle-12细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期变化。 结果： 1. 与对照组相比;PF组H&E染色结果显示肺泡结构完全破坏;病理评分较NS组明显增高（P<0.01）;Masson染色可见肺组织大量条状或片状蓝色胶原纤维;IHC和Western blot结果显示Brg1在PF小鼠肺中表达升高（P<0.05）;且主要增高于SPC+AEC2s（P<0.001）;而CD11b+细胞和α-SMA+细胞中Brg1的表达在2组无统计学差异（P>0.05）;提取小鼠原代AEC2s;IF检测大于90%的细胞为SPC+细胞;Western blot结果证实Brg1在PF组SPC+AEC2s中蛋白水平升高（P<0.05）。 2. 成 功 繁 殖 了 SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre/Brg1fl/fl 纯 合 子 和SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre/Brg1fl/–杂合子小鼠;用多西环素诱导Brg1敲除; RT-PCR和Western blot显示纯合和杂合敲除效率约50%（P<0.05）;同日龄敲除鼠的大体形态及肺组织病理无明显改变;给予Brg1基因敲除鼠BLM建模;与Brg1+/+组相比; Brg1ΔAEII/ΔAEII组生存率明显降低(P<0.05);H&E染色结果显示Brg1ΔAEII/ΔAEII组纤维化病变较Brg1+/+组严重(P<0.01)。Masson染色显示Brg1ΔAEII/ΔAEII纯合敲低组胶原纤维沉积更严重。Sicol法结果也显示Brg1ΔAEII/ΔAEII组胶原蛋白水平明显高于Brg1+/+组(P<0.05)。 3. IHC和Western blot检测发现PCNA蛋白水平Brg1ΔAEII/ΔAEII组较Brg1+/+减少（P<0.001）;IHC检测发现纯合敲除组Brg1ΔAEII/ΔAEII组较同窝野生组Brg1+/+小鼠肺组织中SPC+细胞数量有所减少;且Brg1+细胞明显减少;Brg1+/SPC+细胞比例在Brg1ΔAEII/ΔAEII组较Brg1+/+组降低（P<0.01）;验证了Brg1在AEC2s中被敲低。RT-PCR检测出Mle-12细胞干扰Brg1表达的最佳干扰效率;CCK8和BrdU检测发现干扰Brg1表达后;Mle-12细胞增殖受抑制（P<0.01）;流式细胞术分析发现Mle-12细胞的增殖周期在G0/G1期有差异（P<0.001）。 结论： 1. Brg1在PF中表达升高;且在SPC+AEC2s中表达升高; 2. 敲除AEC2s中Brg1基因不会引起自发性肺纤维化;但可增加BLM诱导的PF的易感性; 3. AEC2s中Brg1表达水平降低可抑制AEC2s的增殖;提示Brg1在PF过程中可能通过调节AEC2s的增殖而在PF的发生发展中起保护性作用。