组织蛋白酶B调控Kupffer细胞caspase-11非经典NLRP3炎症小体激活的机制研究

摘要

目的：炎症小体是位于细胞胞质内的多蛋白复合物，能够激活炎性含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）蛋白激酶，对于机体炎症的发生与控制具有重要的调节作用。其中研究最多的是NOD样受体家族蛋白3（NLR Family Pyrin Domain Containing3，NLRP3）炎症小体，其包括能够感知微生物感染信号的 NLRP3蛋白，配体分子凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC），以及随后被募集激活并产生酶效应的 Caspase-1。通过 NLRP3/ASC激活Caspase-1的方式通常被称为经典 NLRP3炎症小体途径。随着对炎症小体激活机制研究的深入，Caspase-11（人直系同源为 Caspase-4）介导的非经典NLRP3炎症小体途径被发现，即革兰阴性细菌感染时，病菌或脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）进入胞质，募集激活Caspase-11， Caspase-11作用于 Caspase-1，引起白细胞介素1β（Interleukin-1β， IL-1β）、白细胞介素1α（Interleukin-1α，IL-1α）以及白细胞介素18（Interleukin-18，IL-18）的成熟、释放，导致细胞发生炎症性死亡。Caspase-11的激活既可以独立促进细胞发生炎症性死亡以及 IL-1α成熟和分泌，又可以通过增强Caspase-1的激活来增加IL-1β和IL-18产生，因此在非经典NLRP3炎症小体途径中Caspase-11的作用更为关键，其激活对机体的损伤、危害更大。然而，目前对于 Caspase-11激活的确切机制尚不清楚。根据既往研究推测，细胞质内存在某种未被人们发现的由 LPS或革兰氏阴性菌诱导产生的蛋白或者受体，能够与Caspase-11识别并将其激活。与此同时，来自非细胞体系的研究证据显示，组织蛋白酶B（Cathepsin B）是Caspase-11的上游激活物，直接介导了Caspase-11的激活。Hentze等发现，使用LPS与尼日利亚菌素联合刺激THP1细胞后，大量Cathepsin B从溶酶体转移入胞质并迅速活化，同时Caspase-1激活、IL-18生成增多以及细胞死亡增加。因此我们推断，胞质内的LPS或细菌通过影响溶酶体膜的稳定性、通透性，导致大量Cathepsin B从溶酶体外流入胞质并被活化，裂解procasapse-11形成具有酶活性的 Casapse-11，最终导致非经典 NLRP3炎症小体的激活。 方法：本实验共分为3个部分 1．动物实验：利用野生型（wild type,WT）小鼠及TLR4-/-小鼠，给予Cathepsin B抑制剂预处理后建立内毒素血症模型，检测肝脏Kupffer细胞（KCs）中Cathepsin B基因、蛋白表达水平、Cathepsin B从溶酶体外流情况、Caspase-11及Caspase-1激活水平。 2.细胞实验：分离培养TLR4-/-KCs，分别给予Cathepsin B抑制剂预处理或转染Cathepsin BshRNA后，给予大剂量LPS刺激，检测Caspase-11、Caspase-1活化情况以及相应的细胞因子分泌水平。 3.临床标本检测：收集 SIRS以及脓毒症患者外周血标本，检测Cathepsin B蛋白表达及酶活性水平，Caspase-11、Caspase-4激活情况，以及血清中相关炎症因子水平。 结果： 1. WT小鼠及TLR4-/-小鼠内毒素血症模型中，TLR4-/-小鼠生存率及生存时间明显高于WT小鼠；TLR4-/-小鼠KCs中Cathepsin B基因、蛋白表达水平未见明显改变，胞质中Cathepsin B活性明显增加， Caspase-11及Caspase-1激活水平增加，血清中IL-1β、IL-1α以及IL-18等炎症因子水平显著增高；经Cathepsin B抑制剂预处理后，WT小鼠及TLR4-/-小鼠生存时间均增加，两者KCs胞质中Cathepsin B活性明显降低，TLR4-/-小鼠KCs中Caspase-11及Caspase-1激活水平下降，血清中IL-1β、IL-1α以及IL-18等炎症因子水平明显降低。 2．大剂量LPS刺激TLR4-/-KCs，引起胞质内Cathepsin B活性显著增加，Caspase-11、Caspase-1蛋白激活水平明显增加，细胞培养上清中IL-1β、IL-1α以及IL-18等炎症因子水平明显增加；给予Cathepsin B抑制剂预处理或转染Cathepsin BshRNA后，胞质内Cathepsin B活性下降，Caspase-11、Caspase-1蛋白激活水平明显降低，细胞培养上清中IL-1β、IL-1α以及IL-18等炎症因子水平显著下降。 3．与健康志愿者相比较，SIRS、内毒素血症以及脓毒症患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中，Cathepsin B蛋白表达及酶活性水平均增加，Caspase-11、Caspase-4表达水平及激活水平均增加，血清中IL-1β、IL-1α以及IL-18等炎症因子水平显著增高。 结论： 1.在内毒素血症时，存在Cathepsin B在细胞内的分布、活化异常，即胞质内的Cathepsin B活性增加。 2.在活体细胞及动物中，Cathepsin B能够激活Caspase-11从而导致非经典NLRP3炎症小体的活化。 3.下调Cathepsin B蛋白表达或抑制Cathepsin B酶活性，能够降低大剂量LPS对KCs的毒性作用，并且显著延长内毒素血症小鼠的生存时间及生存率，对感染LPS的KCs以及内毒素血症小鼠能够产生有效的保护作用。 4.证实SIRS以及脓毒症患者PBMC中存在Cathepsin B酶活性的增加，以及分布的异常。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料和方法

1.1实验仪器与耗材

1.2主要试剂

1.3动物实验分组与模型建立

1.4细胞分离培养与建模

1.5患者纳入标准与外周血单核细胞分离

1.6检测指标与方法

1.7统计学处理

2结果

2.1大剂量LPS刺激对WT小鼠与TLR4-/-小鼠生存情况及检测指标的影响

2.2不同剂量LPS刺激对WT与TLR4-/-KCs非经典NLRP3炎症小体激活的影响

2.3抑制Cathepsin B活性或沉默Cathepsin B基因对WT与TLR4-/-KCs非经典NLRP3炎症小体激活的影响

2.4 Cathepsin B抑制剂处理对内毒素血症WT与TLR4-/-小鼠生存情况及TLR4-/-小鼠检测指标的影响

2.5临床标本检测指标

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:NLRP3炎症小体激活及调控机制的研究

致谢

攻读学位期间发表的文章