艾叶挥发油在抑制NLRP3炎症小体激活中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及艾叶挥发油在抑制NLRP3炎症小体激活中的应用。本发明公开了在尼日利亚菌素、尿酸钠诱导THP‑1细胞炎症模型中艾叶挥发油抑制NLRP3炎症小体激活中的应用。研究表明，艾叶挥发油可以抑制尼日利亚菌素(Nigericin)、尿酸钠(MSU)等不同属性的激动剂对NLRP3炎症小体的激活，主要表现在抑制NLRP3表达、ASC寡聚体形成、procaspase1的切割活化等，从而抑制炎性细胞因子IL‑lβ、IL18、TNF‑α的产生，最终达到消炎的作用。因此艾叶挥发油可以作为预防或治疗NLRP3炎症小体相关的炎症疾病的药物或者复合药物组分。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及艾叶挥发油在抑制NLRP3炎症小体激活中的应用。

背景技术

炎症小体是细胞在天然免疫过程成中形成的一类蛋白复合体结构，能够被多种刺激因素激活，包括细菌、真菌、晶体、胞外ATP等病原相关分子模式和伤害相关分子模式，因此对天然免疫反应具有重要作用。近年来研究表明炎症小体的过度激活与多种疾病相关。炎症小体识别分子NLRP3基因突变，导致cryopyrin相关周期性综合症(CAPS)，主要表现为多组织中性粒细胞炎症、血液白细胞增多、发热和全身系统性炎症。急性痛风性关节炎、神经退行性疾病、二型糖尿病等病理机制都与炎症小体的异常活化有关，因此研究开发炎症小体相关的抑制剂，有助于改善炎症小体相关的自身免疫性疾病和其他炎症性疾病。NLRP3炎症小体是研究最多最深入、识别的刺激分子最多的炎症小体。NLRP3首先通过NACHT结构域形成寡聚体，招募接头蛋白ASC，后者通过CARD结构域结合procaspase1，procaspase1自剪切成熟，进而剪切活化pro-IL-1β和pro-IL-18，将成熟的IL-1β和IL-18分泌到胞外，同时caspase1剪切gasdermin D，诱导细胞发生炎性死亡。

艾叶挥发油是艾叶的主要活性成分，具有平喘、祛痰、镇咳、抗菌、抗过敏等药理作用。现代研究也证明艾叶挥发油具有抗炎的作用，在如急性耳肿、足水肿以及关节炎等多种不同的炎症疾病中都可以降低IL-1β、TNF-α等炎性因子的表达。但是目前还没有研究报道艾叶挥发油抗炎作用的具体作用机制及靶点，也没有关于艾叶挥发油应用于制备抑制炎症小体激活的药物的记载或报道，也没有给出相关技术启示。因此利用艾叶挥发油开发NLRP3炎症小体抑制剂，抑制NLRP3炎症小体的异常活化，将有利于缓解上述炎症性疾病以及提供新的治疗途径，具有重大意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种艾叶挥发油在抑制NLRP3炎症小体激活中的应用。

本发明的主要创新发现艾叶挥发油在不同激动剂诱导的炎症模型中发挥抑制炎症因子分泌，进而发挥抑制或降低炎症发生的作用机制，主要的发现如下：

本发明提供了一种艾叶挥发油在体外非治疗目的地抑制NLRP3炎症小体激活中的应用。

进一步地，所述的NLRP3炎症小体由尼日利亚菌素或尿酸钠诱导激活。

进一步地，所述的艾叶挥发油通过抑制procaspase1的激活，减少活性caspase1蛋白的产生。

进一步地，所述的艾叶挥发油通过抑制NF-κB p65的磷酸化程度，阻止相关DNA的转录表达，降低NLRP3蛋白的表达水平，抑制NLRP3炎症小体组装过程中ASC寡聚体的形成，进而抑制NLRP3炎症小体的激活。

另外，本发明还提供了一种艾叶挥发油在制备预防和治疗NLRP3炎症小体激活的相关疾病的药物中的应用。

进一步地，所述药物为NLRP3炎症小体抑制剂。

进一步地，所述的NLRP3炎症小体激活的相关疾病为Cryopyrin蛋白相关周期性综合症、急性痛风性关节炎、神经退行性疾病、二型糖尿病、动脉粥样硬化。

进一步地，所述药物包括艾叶挥发油及药学上可接受的载体。

本发明发现艾叶挥发油主要通过两个途径抑制NLRP3炎症小体的激活，一是通过抑制NF-κB p65蛋白的磷酸化，从而降低NLRP3蛋白的表达水平，阻止ASC寡聚体的形成，影响NLRP3炎症小体的组装过程；二是通过抑制procaspase1的激活，减少活性caspase1蛋白的产生，进而抑制NLRP3炎症小体切割炎症因子的功能，最终降低炎症的水平。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

通过本发明的实施例3～10可以证明，艾叶挥发油能够在THP-1细胞中抑制尿酸钠晶体、尼日利亚菌素不同激动剂对NLRP3炎症小体的激活作用。进一步的机制研究证明，艾叶挥发油通过降低NLRP3蛋白表达水平、抑制ASC寡聚体的形成及无活性的酶原procaspase1的活化，从而阻止NLRP3炎症小体的组装和活性，进而减少炎性细胞因子IL-lβ、IL18、TNF-α的产生，最终达到消炎的作用。因此，艾叶挥发油在作为预防或治疗NLRP3炎症小体相关的炎症疾病的潜在药物或者复合药物组分上具有十分重要的意义。

附图说明

图1显示的是本发明实施例3中水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油对尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体的抑制作用；

图2显示的是本发明实施例4中超临界CO

图3中，图3A，图3B显示的是本发明实施例5中艾叶挥发油对尼日利亚菌素诱导的IL-1β产生和LDH释放的抑制作用；图3C显示的是本发明实施例5中艾叶挥发油不能抑制尼日利亚菌素诱导的TNF-α的产生；图3D显示的是本发明实施6中艾叶挥发油不能抑制尼日利亚菌素诱导的ASC蛋白寡聚体的形成；

图4显示的是本发明实施例7中水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油对尿酸钠(MSU)诱导的NLRP3炎症小体的抑制作用；

图5显示的是本发明实施例8中超临界CO

图6显示的是本发明实施例9中艾叶挥发油对尿酸钠诱导的ASC蛋白寡聚体形成的抑制作用；

图7显示的是本发明实施例10中艾叶挥发油对尿酸钠诱导的NLRP3蛋白表达和p65蛋白的磷酸化程度的抑制作用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。

其中，本发明所用试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。

实施例1：水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油

取自然干燥的艾叶500g在蒸馏水中冷浸2h后按水蒸汽蒸馏法加热提取。回流4h后，分出挥发油，加入少量无水硫酸钠干燥，即得到蓝绿色具有浓郁香气的挥发油2ml。按每克艾叶提取的挥发油体积(ml)计算得率为0.4％。

实施例2：超临界CO

取自然干燥的艾叶500g，用粉碎机粉碎，装入超临界萃取装置；打开水浴，使萃取装置达到设定的温度(55℃)；通入CO

实施例3：水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油对尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体的抑制作用

将8×10

结果如图1A和1B所示，91、68ug/ml水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油能显著抑制细胞上清中IL-1β切割体(IL-1βp17)和caspase1切割体(caspase1 p10)的产生，但不影响胞浆内pro-IL-1β、pro-caspase1的含量。同时91、68ug/ml水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油能显著抑制细胞焦亡相关蛋白GSDMD的切割体(GSDMD p35)的产生(图1C)，但不影响NLRP3炎症小体复合物组成蛋白ASC和NLRP3的含量(图1C和1D)，说明水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油能抑制尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体的激活，导致IL-1β切割体(IL-1βp17)、caspase1切割体(caspase1 p10)和GSDMD的切割体(GSDMD p35)含量减少。

实施例4：超临界CO

将8×10

结果如图2A和2B所示，182、136.5ug/ml超临界CO

实施例5:艾叶挥发油抑制尼日利亚菌素诱导的IL-1β产生和LDH的释放

将1.8×10

结果如图3A所示，不同浓度的水蒸气蒸馏法提取艾油(SDAOH、SDAOM、SDAOL分别为91、68、45.5ug/ml)和超临界CO

将1.6×10

以上结果说明水蒸气蒸馏法和超临界CO

实施例6：艾叶挥发油不能抑制尼日利亚菌素诱导的ASC蛋白寡聚体形成

将8×10

结果如图3D所示，水蒸气蒸馏法和超临界CO

实施例7：水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油对尿酸钠(MSU)诱导的NLRP3炎症小体的抑制作用

将8×10

结果如图4A和4B所示，45、33.75ug/ml水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油能显著抑制细胞上清中IL-1β切割体(IL-1βp17)和caspase1切割体(caspase1 p10)的产生，但不影响胞浆内pro-IL-1β、pro-caspase1的含量。同时45、33.75ug/ml水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油能显著抑制细胞焦亡相关蛋白GSDMD的切割体(GSDMD p35)的产生(图4C)，但不影响NLRP3炎症小体复合物组成蛋白ASC含量(图4C)，说明水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油能抑制尿酸钠诱导的NLRP3炎症小体的激活，导致IL-1β切割体(IL-1βp17)、caspase1切割体(caspase1p10)和GSDMD的切割体(GSDMD p35)含量减少。

将1.8×10

将1.6×10

以上结果说明水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油能抑制尿酸钠诱导的NLRP3炎症小体的激活。

实施例8：超临界CO

将8×10

结果如图5A和5B所示，136、102、68ug/ml超临界CO

将1.8×10

将1.6×10

以上结果说明超临界CO

实施例9：艾叶挥发油抑制尿酸钠诱导的ASC蛋白寡聚体形成

将8×10

结果如图6A和6B所示，45、33.75ug/ml水蒸气蒸馏法和136、102ug/ml超临界CO

实施例10：艾叶挥发油抑制尿酸钠诱导的NLRP3蛋白表达和p65蛋白的磷酸化程度

将8×10

结果显示，尿酸钠刺激导致NLRP3蛋白表达增加(图7A和7B)，水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油和超临界CO

以上结果说明，艾叶挥发油可以抑制尿酸钠诱导的NLRP3蛋白增加现象，其机制可能与抑制调控NLRP3蛋白表达的NF-κB p65蛋白的活性有关。艾叶挥发油通过抑制NLRP3蛋白的表达，导致在尿酸钠刺激的条件下NLRP3炎症小体的组装过程受到影响，从而最终抑制NLRP3炎症小体的激活。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。