G6PD缺陷症的诊断和基因治疗实验研究

摘要

目的： G6PD缺陷症是常见的单基因遗传性酶缺陷病，目前尚无根治疗法，大规模人群筛查是目前预防疾病的主要手段，同时寻找新型治疗策略也是世界各国研究的重点。CRISPR/Cas9是一种新型基因编辑技术，具有安全性高、特异性强和精确可靠等优点，是一种极具临床应用价值的新技术。目前，利用 CRISPR/Cas9技术治疗假肥大性肌营养不良、地中海贫血、血友病等单基因遗传病已在多个实验室开展。本文对重庆地区儿童进行G6PD酶活性和基因筛查，找出最具临床研究价值的突变位点；利用 CRISPR/Cas9技术进行定点修复，为G6PD缺陷症治疗提供新策略。 方法： 应用多色探针熔解曲线法和G6PD/6PGD定量比值法分别检测G6PD基因突变和酶活性，找出突变频率高且G6PD酶活性低的突变位点。针对此位点设计两对sgRNA，构建PX458-G6PD-sgRNA重组质粒。转染HEK293细胞系后，分别在体内和体外采用T7核酸内切酶Ⅰ法（T7EⅠ）和用cas9蛋白酶法检测每对sgRNA的编辑效率。Sanger测序、G6PD/6PGD比值法、荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CRISPR/Cas9定点敲除的单克隆细胞株的DNA序列、G6PD酶活性、mRNA和蛋白水平的变化。最后联合CRISPR/Cas9和单链寡核苷酸(ssODN)同源重组修复G6PD缺陷症。 结果： 通过 sanger测序证实 Cas9和 sgRNA表达质粒PX458-G6PD-sgRNA构建成功；在体内用T7E1核酸内切酶法鉴定sgRNA1和sgRNA2的编辑效率分别为6.74%和12.36%；在体外用Cas9蛋白酶法鉴定分别为15%和17%。鉴定筛选出定点敲除G6PD基因1376G>T位点的HEK293单克隆细胞株，G6PD酶活性和mRNA水平显著下降。PX458-G6PD-sgRNA2质粒与ssODN共转染修复了1376G>T突变位点，G6PD酶活性、mRNA水平均恢复正常。 结论： 本研究首次对重庆地区儿童进行G6PD缺乏症的流行病学调査，掌握了本地区G6PD缺乏症的发病情况，发现1376G>T位点最具临床研究价值。CRISPR/Cas9通过同源重组定点修复了G6PD基因，为寻找G6PD缺陷症等遗传性血液病的新型疗法奠定理论及实践基础。

目录

声明

英汉缩略名词对照

前言

第一部分 G6PD缺陷症的诊断

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 利用CRISPR/Cas9技术定向敲除G6PD基因1376G>T突变位点

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 CRISPR/Cas9同源重组定点修复G6PD缺陷症

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:CRISPR/Cas9技术治疗单基因遗传病的研究进展

致谢

攻读研究生期间发表的文章