TGF-β1激活Smad2/3信号诱导Treg细胞免疫反应参与肺炎链球菌疫苗SPY1的免疫保护

摘要

目的：探究肺炎链球菌减毒活菌疫苗SPY1诱导特异性Treg细胞的产生机制及Treg细胞参与疫苗保护性免疫的效应机制。 背景：疫苗的有效性主要取决于其免疫保护机制，因此，阐明疫苗的保护机制是新型疫苗研发的关键部分。SPY1是本课题组前期研发的一株肺炎链球菌减毒活菌疫苗，该疫苗毒力显著降低，遗传稳定性高，安全性好，保护效果优于现有的商品化多糖疫苗。在之前的研究中，我们发现SPY1可诱导产生保护性的特异性Treg免疫反应，然而，其潜在机制并不清楚。TGF-β是Treg细胞分化的关键细胞因子，我们前期使用TGF-β1活性抑制物多肽P17处理SPY1免疫小鼠，疫苗的保护效果明显降低，表明 SPY1诱导的 TGF-β1对获得性免疫中保护性Treg细胞免疫应答的重要性。由此我们提出疑问：TGF-β1是通过何种信号通路诱导了SPY1特异性Treg细胞的分化？SPY1特异性Treg细胞又是通过何种方式参与了疫苗对小鼠的保护性免疫？本研究拟进一步探索 SPY1免疫诱导特异性 Treg细胞的产生及效应机制，为阐明SPY1疫苗的保护效应机制提供理论和实验依据。1 主要研究方法： 1. C57BL/6J小鼠随机分为四个组：未免疫CT组，未免疫P17处理组CT+P17，免疫组CT+SPY1和P17处理免疫组CT+SPY1+P17。一共进行四次SPY1滴鼻免疫，每次间隔一周。在免疫期间，CT+P17和CT+SPY1+P17组小鼠每天腹腔注射100μg P17，CT和CT+SPY1组小鼠腹腔注射100μg PBS，在肺炎链球菌19F或D39攻毒前2 h和4 h，P17处理的小鼠腹腔注射500μg P17。 2.免疫期间监测小鼠体重，末次免疫后第7天肺炎链球菌D39攻毒，观察并记录小鼠体重变化和生存时间，检测 P17对 SPY1免疫保护效果的影响。 3. ELISA检测70%乙醇灭活SPY1刺激的免疫小鼠脾细胞分泌的细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-12p70、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17A、IL-10）水平。H&E染色观察肺炎链球菌19F攻毒后小鼠肺损伤情况并通过ELISA检测肺匀浆中细胞因子水平。 4. ELISA检测SPY1免疫后小鼠肺匀浆、脾匀浆和脾细胞上清中活化的TGF-β1水平。肺炎链球菌19F感染后，PCR和免疫组化实验分别检测小鼠肺中 tgf-β1 mRNA和活化 TGF-β1的表达。PCR筛选TGF-β-Smad依赖和非依赖途径信号分子的转录水平,WB和免疫荧光实验进一步验证，确定SPY1免疫诱导特异性Treg细胞分化的信号通路。 5.流式细胞术分析肺炎链球菌19F攻毒后 Treg细胞上 PD-1和CTLA-4的表达，检测PD-1和CTLA-4在SPY1保护性免疫中的作用。实验结果： 1.在致死性肺炎链球菌D39感染小鼠模型中，Treg细胞抑制剂P17处理的SPY1免疫小鼠生存时间较未经P17处理免疫小鼠的明显缩短，证明SPY1诱导的Treg免疫反应对小鼠的免疫保护作用。 2. ELISA检测小鼠脾细胞分泌的细胞因子显示，P17可进一步上调SPY1免疫组中免疫细胞因子（IL-12p70、INF-γ、IL-4、IL-5、IL-17A）和感染相关炎症细胞因子 TNF-α的表达，并下调免疫调控因子 IL-10和抑炎细胞因子IL-6的水平。H&E染色显示，19F攻毒后P17处理的SPY1免疫小鼠肺组织损伤和炎症反应较未注射的免疫小鼠加重，小鼠肺匀浆中细胞因子的变化与脾上清中的变化趋势一致。 3. PCR和免疫组化实验结果显示，SPY1免疫后小鼠肺中Foxp3的表达增加。ELISA检测发现 SPY1免疫小鼠肺匀浆、脾匀浆和脾细胞上清中活化的TGF-β1水平均上调。同样，PCR和免疫组化进一步证明，在19F攻毒后，SPY1免疫对TGF-β1表达的上调可被P17处理逆转。 4.在 SPY1免疫小鼠中，信号通路分子 smad2、smad3和 smad4的表达显著增加，smad7的表达显著下调，WB实验显示SPY1免疫小鼠中Smad2/3，磷酸化Smad2/3的表达增加，TGF-β负调控因子Smad7的表达降低，并均可被 P17处理逆转，证明 SPY1免疫激活TGF-β1-Smad2/3信号通路。 5.流式细胞术结果显示，19F攻毒后SPY1免疫诱导的Treg细胞上PD-1和CTLA-4的表达增加。 结论：抑制TGF-β1能够显著降低疫苗SPY1对S. pneumoniae定植引起肺损伤的保护，SPY1刺激的TGF-β1对SPY1诱导的系统性保护性免疫应答之间的平衡是必要的。激活的TGF-β1-Smad2/3信号通路参与了SPY1特异性Treg细胞的产生，Treg细胞通过PD-1和CTLA-4的表达增加参与疫苗的免疫保护作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 TGF-β1参与肺炎链球菌疫苗SPY1诱导的保护性免疫应答平衡

1材料和方法

2结果

3讨论

第二部分 SPY1特异性Treg细胞产生的信号通路和效应机制

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:调节性T细胞及其在疫苗中的运用

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文