结核分枝杆菌PPK2核酸适配体的抗结核效果评价

摘要

目的: 探讨结核分枝杆菌多聚磷酸盐激酶2（PPK2）核酸适配体（aptamer）与体外结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）共培养来评估其抑菌效果。为开发新的高效、低毒的抗结核药物提供新的方向。 方法: 1.运用生物信息学方法分析PPK2蛋白氨基酸序列与呼吸道部分常见病原菌同源性进行分析，并构建PPK2进化树。 2.将PPK2核酸适配体与MTB标准株H37Rv、卡介苗（BCG）、耻垢分枝杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌，通过酶联寡核苷酸分析（enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA）方法测定PPK2核酸适配体与H37Rv结合亲和力，用相同的方法检测PPK2适配体与正常人、结核病人血清中PPK2蛋结合的亲和力。 3.将PPK2核酸适配体加入不同浓度血清中共孵育24h，运用琼脂糖凝胶电泳分析其在不同浓度血清中的生物稳定性。 4.采用微量刃天青显色法测定PPK2核酸适配体对H37Rv的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。 5.将H37Rv与1μmol/L的PPK2核酸适配体、随机序列接种到罗氏培养基，观察PPK2适配体与随机序列对H37Rv生长影响。将H37Rv与PPK2核酸适配体、突变体共培养10d，运用酶标仪测定D（600nm）值，观察PPK2核酸适配体对H37Rv的生长影响。 6.将H37Rv与PPK2适配体共培养5周,采用结晶紫染色法观察PPK2适配体对MTB生物膜生长的影响。 7.将PPK2核酸适配体与细胞共培养，观察核酸适配体对细胞毒性。 结果: 1.生物信息学方法分析构建PPK2进化树显示H37Rv的PPK2蛋白与呼吸道部分常见病原菌亲缘性较远，与铜绿假单胞菌亲缘关系相对较近。 2.通过ELONA测定显示PPK2核酸适配体能与H37Rv的PPK2蛋白选择性结合，在正常人与结核病病人血清中PPK2核酸适配体在结核病病人血清表现出较好的亲和力。 3.琼脂糖凝胶电泳分析PPK2核酸适配体在血清中至少稳定存在8h。 4.PPK2核酸适配体对结核分枝杆菌标准株 H37Rv的 MIC为50nmol/L。 5.罗氏培养基菌落生长显示PPK2适配体对H37Rv生长具有抑制作用。生长抑制试验表明随着PPK2核酸适配体浓度增加H37Rv的D（600nm）值呈现下降趋势，说明PPK2核酸适配体对H37Rv生长存在抑制作用。 6.PPK2核酸适配体与MTB共培养5周，经过结晶紫染色法测定显示PPK2核酸适配体影响MTB生物膜形成。 7.细胞毒性试验显示高浓度与低浓度PPK2核酸适配体对细胞均无毒性。 结论: 1.PPK2蛋白核酸适配体对体外H37Rv表现出良好的抑菌活性。 2.PPK2核酸适配体能够与结核病人血清PPK2蛋白选择性结合。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 PPK2蛋白进化树构建

2.2 ELONA测定PPK2核酸适配体与H37Rv选择性结合

2.3 PPK2核酸适配体与结核病人血清结合实验

2.4 PPK2核酸适配体的生物稳定性

2.5 PPK2核酸适配体对H37Rv的抑菌活性试验

2.6 PPK2核酸适配体对结核分枝杆菌H37Rv生物膜形成的影响

2.7 PPK2核酸适配体对细胞毒性实验

3 讨论

全文小结

参考文献

文献综述:核酸适配体在靶向治疗中的应用

致谢

硕士期间发表文章