脑微血管内皮细胞抗结核分枝杆菌感染的分子机制及结核分枝杆菌跨越血脑屏障体外模型的初步研究

摘要

结核性脑膜炎主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，是结核病最严重的一种形式，主要发生于幼儿和HIV感染病人，具有高致死率的特点。结核性脑膜炎的发生是由于结核分枝杆菌随血液循环到达中枢神经系统所致，而中枢神经系统由脑微血管内皮细胞构成的血脑屏障保护。尽管体内和体外实验研究均表明结核分枝杆菌可以跨越血脑屏障。但是，结核分枝杆菌跨越血脑屏障的细胞和分子机制仍然不清楚。
　　本研究以分枝杆菌为研究对象，以脑微血管内皮细胞为模型，通过研究分枝杆菌与细胞相互作用及构建血脑屏障体外模型，以期解释脑微血管内皮细胞在抗分枝杆菌感染在中的作用及分枝杆菌跨越血脑屏障的机制。主要内容如下:
　　1.分枝杆菌感染鼠脑微血管内皮细胞的受体分析。为了研究CD44在分枝杆菌感染鼠脑微血管内皮细胞中的作用，我们分别用牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv感染细胞，在特定时间点进行透射电子显微镜，激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞仪器检测及采用CD44中和抗体进行阻断分析。透射电子显微镜结果显示牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv均可感染并内化到鼠脑微血管内皮细胞吞噬泡内，并且二者之间没有显著性差异。激光共聚焦扫描显微镜结果显示CD44表达在脑微血管内皮细胞表面，而细胞质内也有少量的CD44表达。同时，我们发现CD44可以募集到分枝杆菌感染位点，但是，CD44的表达不受分枝杆菌感染的影响。然而，CD44中和抗体不能阻断分枝杆菌感染并内化到鼠脑微血管内皮细胞内。以上结果说明分枝杆菌可以感染并内化到鼠脑微血管内皮细胞，但CD44不参与这一过程。
　　2.分枝杆菌在鼠脑微血管内皮细胞中存活的分析。为了研究分枝杆菌是否在鼠脑微血管内皮细胞中繁殖，我们分别用牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv感染细胞，在特定时间点进行胞内存活实验及显微镜计数。结果发现在无抗生素的条件下结合及内化到细胞内的牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv数量先降低而后升高，但当在抗生素存在的条件下二者在细胞内的活菌数量呈现显著性下降的趋势。在不同时间点取细胞培养上清进行细菌计数，发现在无抗生素的条件下牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv均可在培养上清中繁殖，但是在抗生素存在条件下则检测不到活菌的存在。此外，我们也用显微镜计数进行进一步的研究，结果发现在抗生素存在情况下，随着时间延长，细胞感染的百分比，包含10个以上细菌的细胞数及细菌总数均呈现下降的趋势。以上结果说明牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv不能在鼠脑微血管内皮细胞中繁殖。
　　3.分枝杆菌感染对鼠脑微血管内皮细胞的影响。为了研究是否分枝杆菌感染对鼠脑微血管内皮细胞产生细胞毒性效应，我们用牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv感染细胞，在不同的时间点固定细胞进行显微镜观察，测定LDH及统计台盼兰阳性细胞的百分比。结果发现牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv感染及在细胞中的持续存在均不破坏鼠脑微血管内皮细胞单层细胞结构。另外，感染细胞LDH的释放量及台盼兰阳性细胞的数量也没有显著性上升。说明分枝杆菌感染和持续存在不对鼠脑微血管内皮细胞产生细胞毒性效应。
　　4.分枝杆菌在鼠脑微血管内皮细胞中的运输分析。为了研究是否分枝杆菌被鼠脑微血管内皮细胞降解，从而不能在该细胞中繁殖。我们分别用牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv感染鼠脑微血管内皮细胞，并用吞噬体特异性分子，Rab5和Rab7，及溶酶体特异性分子，LAMP2和Cathepsin L细胞并进行激光共聚焦显微镜分析。结果发现牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv吞噬体均可以被Rab5，Rab7，LAMP2和Cathepsin L分别标记，并且随着时间的延长被Rab5标记的吞噬体的数量显著性降低，被Rab7和LAMP2共同标记的吞噬体则显著性上升，说明包含分枝杆菌的吞噬体成熟为吞噬溶酶体。另外，牛分枝杆菌BCG可以被Cathepsin L强标记，但是结核分枝杆菌H37Rv则不能，说明后者可以延缓吞噬溶酶体的酸化。以上结果说明分枝杆菌吞噬体成熟为吞噬溶酶体，进而被细胞降解。
　　5.分枝杆菌逃逸到鼠脑微血管内皮细胞质的分析。为了研究分枝杆菌是否可以逃逸到细胞质，从而躲避脑微血管内皮细胞的快速杀伤作用，我们用SpiOC18和Phalloidin共同标记细胞后进行激光共聚焦显微镜分析。结果发现一定数量的结核分枝杆菌H37Rv不能被SpiOC18进行标记，而牛分枝杆菌BCG则不能，说明该毒力菌株具有逃逸到细胞质的能力。最后，我们检测了结核分枝杆菌H37Rv是否可以逃出细胞，结果发现当没有抗生素的情况下牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌H37Rv感染细胞可以形成菌落簇，而当抗生素存在的情况下菌落簇则消失，说明二者均不能逃出细胞。以上结果说明结核分枝杆菌H37Rv通过逃逸到细胞质而逃避细胞的快速杀伤作用，但是细胞质内的细菌则不能逃出细胞。
　　6.分枝杆菌在人脑微血管内皮细胞和人星形胶质细胞中的存活分析。为了研究分枝杆菌是否在人脑微血管内皮细胞和人星形胶质细胞中繁殖，我们分别用牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌毒力菌株H37Rv感染细胞，在特定时间点进行胞内存活实验。结果发现在抗生素存在的条件下，人脑微血管内皮细胞和人星形胶质细胞内的分枝杆菌活菌数量呈现显著性下降的趋势。此外，我们发现二者也不能逃出细胞并感染临近细胞。以上的结果说明分枝杆菌不能在人脑微血管内皮细胞和人星形胶质细胞中繁殖，同时也不能逃出感染细胞。
　　7.分枝杆菌跨越血脑屏障双层细胞模型的分析。为了研究是否分枝杆菌跨越血脑屏障通过细胞间隙途径及外周血单核细胞在分枝杆菌跨越血脑屏障中的作用，我们用人脑微血管内皮细胞和人星形胶质细胞构建了血脑屏障体外模型，分别用游离的分枝杆菌和感染了分枝杆菌的巨噬细胞感染血脑屏障体外模型。结果发现结核分枝杆菌毒力菌株H37Rv可以跨越该血脑屏障体外模型，同时，伴随着该屏障结构通透性的改变，表现为TEER的显著性降低和对Na-F通透性的增强。然而，牛分枝杆菌BCG则不能跨越该屏障结构。有意思的是，包含细菌的巨噬细胞感染血脑屏障后可以引起通透性的改变，但是只有毒力菌株可以跨越血脑屏障。
　　以上结果说明结核分枝杆菌跨越血脑屏障可能通过细胞间隙并伴随着血脑屏障通透性的改变，而单核细胞也可能在此过程中发挥着作用。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第1章 文献综述

1．1 结核性脑膜炎简介

1．1．1 结核性脑膜炎的致病机制

1．2 结核分枝杆菌与宿主细胞相互作用

1．2．1 受体介导的宿主细胞吞噬结核分枝杆菌

1．2．2 结核分枝杆菌在细胞中的存活机制

1．3 结核分枝杆菌跨越血脑屏障的机制

1．3．1 血脑屏障

1．3．2 血脑屏障体外模型的研究

1．3．3 实验动物模型的研究

第2章 研究目的及意义

第3章 脑微血管内皮细胞抗结核分枝杆菌感染的分子机制的研究

前言

3．1 实验材料

3．1．1 细胞、菌株及培养条件

3．1．2 抗体与试剂

3．1．3 主要培养基及其配制

3．1．4 缓冲液及其配制

3．2 实验方法

3．2．1 感染菌液的制各

3．2．2 侵袭试验

3．2．3 透射电子显微镜技术

3．2．4 CD44在分枝杆菌感染中的作用分析

3．2．5 分枝杆菌感染对CD44表达的影响

3．2．6 CD44中和抗体封闭实验

3．2．7 胞内存活试验

3．2．8 细菌计数和细胞形态观察

3．2．9 分枝杆菌在脑微血管内皮细胞中的运输分析

3．2．10 乳酸脱氢酶释放试验及细胞计数

3．2．11 分枝杆菌逃逸到细胞质的分析

3．2．12 分枝杆菌细胞问直接接触感染的分析

3．3 结果

3．3．1 分枝杆菌感染脑微血管内皮细胞

3．3．2 分枝杆菌感染不影响CD44表达

3．3．3 分枝杆菌内化到脑微血管内皮细胞不依赖CD44

3．3．4 分枝杆菌不能在鼠脑微血管内皮细胞内繁殖，但可以在细胞外繁殖

3．3．5 分枝杆菌感染不诱导细胞毒性

3．3．6 分枝杆菌在脑微血管内皮细胞不能阻断吞噬体与溶酶体融合

3．3．7 结核分枝杆菌毒力菌株逃逸到细胞质

3．3．8 分枝杆菌不能细胞间直接接触感染

3．4 讨论

第4章 结核分枝杆菌穿过血脑屏障体外模型的初步研究

前言

4．1 实验材料

4．1．1 细胞、菌株及培养条件

4．1．2 实验试剂及配制

4．2 实验方法

4．2．1 血脑屏障体外模型的构建

4．2．2 感染菌液的制备

4．2．3 胞内存活实验

4．2．4 分枝杆菌细胞间直接接触感染的分析

4．2．5 单核巨噬细胞感染分枝杆菌的准备

4．2．6 血脑屏障体外模型的感染

4．2．7 血脑屏障通透性的检测

4．3 结果

4．3．1 分枝杆菌持续存在于人脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞

4．3．2 分枝杆菌不能直接跨细胞感染

4．3．3 结核分枝杆菌跨越血脑屏障

4．3．4 结核分枝杆菌跨越血脑屏障伴随着通透性的改变

4．4 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

个人资料

教育经历

在读期间发表的主要文章